一种真核启动子及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种真核启动子及其制备方法和应用，该启动子包括14种具有不同转录活性的突变CMV启动子中的任意一种，由人野生型CMV启动子中的NF‑κB结合位点以不同的组合方式替换人工碱基序列获得。本发明专利技术制备得到一系列新的哺乳动物启动子，其中三种启动子(T1P2、T1和P2)具有比人野生型CMV更强的转录活性，这三种启动子高转录活性启动子在这些生物医学领域具有潜在的重要应用价值。此外，还产生了一系列具有各种转录活性的工程化哺乳动物启动子，可以用于灵活控制合成生物学中的基因表达输出量。本发明专利技术真核启动子的制备方法，作为一种新方法用于制造具有不同转录活性的启动子，简单方便，成功率高。

【技术实现步骤摘要】
一种真核启动子及其制备方法和应用
本专利技术属于生物
，具体涉及一种真核启动子及其制备方法和应用。
技术介绍
外源基因在哺乳动物细胞中的表达对于转基因治疗试验、DNA疫苗以及药物产品的生产和细胞生物学的基础研究是必需的。哺乳动物表达系统中外源基因的表达水平主要与表达载体中启动子的转录强度相关。因此，真核细胞中外源基因的表达，具有恰当的启动子至关重要。这些启动子在医学、药物及生物医学的药品生产、基因治疗，以及生命科学基础研究中具有重要应用价值。真核启动子的研发在基因治疗和药品生产领域具有特别重要的价值。三十年前，研究人员在人巨细胞病毒(CMV)的基因组DNA(gDNA)中鉴定了出了强转录增强子/启动子(以下称为启动子)，这个启动子序列位于重要的极早期(IE)基因的转录起始位点(TSS)的上游，是已知最强的启动子序列之一。通常，CMVIE启动子和人延伸因子α(EF-1α)启动子是各种哺乳动物细胞系中转录活性最强的两个启动子。在一些研究中，小鼠巨细胞病毒IE启动子启动效率也许会更高一些。然而，在人细胞(例如293EBNA或CHO-K1-S细胞)中，带有内含子A的CMV启动子在瞬时和稳定转染中蛋白质表达水平都是最高的。有研究在CHO细胞中使用Lonza'sGS系统(工业中用于哺乳动物基因表达的常用载体之一)表达单克隆抗体(mAb)来比较两种启动子的表达能力，结果显示，小鼠CMV启动子比人CMV启动子效率要低。研究人员已经确认人CMV启动子在很多细胞中具有高转录活性，而且该转录调控元件在转基因动物的组织表达中具有广泛的转录活性。在早期和最近的研究中，CMV启动子也已经被普遍用作各种基因表达载体的基础元件。全长人CMV启动子含有多个转录因子结合位点(TFBSs)，其中许多顺式作用元件多次重复出现，包括多个NF-κB/rel、CREB/ATF、AP1、视黄酸受体(RAR)、SP-1、血清应答因子(SRF)和ELK-1的DNA结合位点。四个NF-κB结合位点与TSS的距离各不同。一些研究表明NF-κB/rel位点不仅负责调节人CMV-IE增强子的活性，而且控制启动子基本的转录活性。然而也有一些研究人员认为，四个NF-κB结合位点对于CMV启动子激活是可有可无的。但以上结论并不是绝对的，该研究中，CMV启动子顺式作用元件的研究是在全病毒基因组感染细胞的背景下进行的，而实际上，CMV启动子通常用作载体系统中的转录调节元件。一些研究通过TNFα和IE1对CMV启动子的刺激，得出以下结论，CMV启动子中NF-κB结合位点与TSS和基因序列的距离不同，其对转录活性的影响会有区别。位点4和2发挥最主要的作用，位点3发挥的作用次之，而序列中保守但远离TSS的位点1对启动子的调节没有影响。但也有研究表明位点2和3分别表现为主要作用位点和低影响力的位点。很难得出确定的结论，这些顺式作用元件中的哪一个负责启动子的活化或抑制。重要的是，这些研究表明，CMV启动子是通过各种功能的顺式作用元件之间的相互作用来调节整体的转录功能。这些顺式作用元件形成了跨越整个增强子的功能网络。启动子的设计和改造通常是为了获得各种不同的功能性启动子，包括高转录活性和持续表达能力，或产生各种不同强度的基因表达。可以通过去除对表达有不利影响的序列或引入有利于基因表达的因子来改造启动子。例如，人CMV启动子中的PDX1结合位点显示为阻抑物，去除该位点后，瞬时荧光素酶实验中表达增加四倍。在CMV启动子上游插入ZFP-2392v的结合位点之后也观察到基因表达增强。去除由于DNA甲基化而倾向于基因沉默的CpG二核苷酸位点也可以改善转基因的表达稳定性。商业生产和文献报道中，用不同调节元件组合成的启动子已广泛用于各种表达载体，从而使哺乳动物细胞高水平生产重组蛋白。已经有报道称，第一外显子和内含子A在瞬时和稳定转染中对基因表达具有积极效应。融合不同增强子和核心启动子的杂合启动子也可以增强转录活性或调节表达。已经知道CMV启动子是迄今为止鉴定的最强的转录控制元件，一些研究在细胞启动子的5'末端添加了CMV增强子区域以提高其转录活性。增强启动子活性的另一种方法是将随机地或已知的随机顺式作用元件进行串联延伸，构建合成增强子和核心启动子。在一项研究中，研究人员将10个碱基的DNA序列进行随机组合，通过微阵列打印技术串联重复序列，组装成100个碱基对的合成增强子。发现在HeLa细胞中，其中一个增强子的转录活性达到人CMV增强子的两倍。此外，合成生物学也已经成为启动子设计和改造的重要手段。但是现有技术中野生型人巨细胞病毒启动子(wild-typeCMV，wtCMV)，活性单一不能灵活控制合成生物学中的基因表达输出量(output)，并且缺乏高活性启动子。特别是目前生物技术高效大量制备药物蛋白，需要高活性真核启动子。
技术实现思路
专利技术目的：针对现有技术存在的问题，本专利技术提供一种真核启动子，该真核启动子不仅包括专利技术高转录活性启动子，还包括一系列具有各种转录活性的工程化哺乳动物启动子，可以用于灵活控制合成生物学中的基因表达输出量。本专利技术还提出了一种真核启动子的制备方法，作为一种新方法用于制造具有不同转录活性的启动子。最后本专利技术还提供真核启动子在生物及医学领域的应用。技术方案：为了实现上述目的，如本专利技术所述一种真核启动子，包括14种具有不同转录活性的突变CMV启动子：T1P2、T1P24、S12、S124、T1、T2、T3、T4、P1、P2、P3、P4、P12或P12S34中的任意一种，所述14种启动子分别命名为mCMV1～mCMV14，其碱基序列分别如SEQIDNO.1～SEQIDNO.14所示。其中，所述启动子为基于人野生型CMV(人wtCMV)启动子改造获得的具有不同转录活性的突变CMV(mCMW)启动子。其中，所述启动子T1P2、T1和P2为高转录活性真核启动子。本专利技术所述真核启动子的制备方法，包括如下步骤：将人wtCMV启动子中的NF-κB结合位点以不同的组合方式替换人工碱基序列，以此获得具有不同转录活性的突变CMV启动mCMV1～mCMV14。其中，所述NF-κB结合位点有4个，其碱基序列和碱基位置分别为：wtBS1：GGGACTTTCC(-422～-413，指该位点位于转录起始位点(TSS)上游422～413处)；wtBS2：GGGACTTTCC(-271～-262，指该位点位于转录起始位点(TSS)上游271～262处)；wtBS3：GGGGATTTCC(-166～-157，指该位点位于转录起始位点(TSS)上游166～157处)；wtBS4:GGGACTTTCC(-103～-94，指该位点位于转录起始位点(TSS)上游103～94处)；所述人工碱基序列为BS-T：GGGGTTTCCC；BS-P：GGGGATTCCC；BS-S：TAGTAACGCC。作为优选，所述mCMV1用BS-T替代人wtCMV启动子中的wtBS1，用BS-P替代人wtCMV启动子中的wtBS2。作为优选，所述mCMV2用BS-T替代人wtCMV启动子中的wtBS1，用BS-P分别替代人wtCMV启动子中的wtBS2和wtBS4。作为优选，所述mCMV3用BS-S分别替代人wtCMV启动子中的wtB本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种真核启动子，其特征在于，包括14种具有不同转录活性的突变CMV启动子：T1P2、T1P24、S12、S124、T1、T2、T3、T4、P1、P2、P3、P4、P12或P12S34中的任意一种，所述14种启动子分别命名为mCMV1～mCMV14，其碱基序列分别如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.14所示。

【技术特征摘要】
1.一种真核启动子，其特征在于，包括14种具有不同转录活性的突变CMV启动子：T1P2、T1P24、S12、S124、T1、T2、T3、T4、P1、P2、P3、P4、P12或P12S34中的任意一种，所述14种启动子分别命名为mCMV1～mCMV14，其碱基序列分别如SEQIDNO.1～SEQIDNO.14所示。2.根据权利要求1所述的真核启动子，其特征在于，所述启动子为基于人野生型CMV启动子改造获得的具有不同转录活性的突变CMV启动子。3.根据权利要求1或2所述的真核启动子，其特征在于，所述启动子T1P2、T1和P2为高转录活性真核启动子。4.一种权利要求1所述真核启动子的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：将人野生型CMV启动子中的NF-κB结合位点以不同的组合方式替换人工碱基序列，以此获得具有不同转录活性的突变CMV启动子mCMV1～mCMV14。5.根据权利4所述的制备方法，其特征在于，所述NF-κB结合位点有4个，其碱基序列和碱基位置分别为：wtBS1：GGGACTTTCC(-422～-413)；wtBS2：GGGACTTTCC(-271～-262)；wtBS3：GGGGATTTCC(-166～-157)；wtBS4:GGGACTTTCC(-103～-94)；所述人工碱基序列为BS-T：GGGGTTTCCC；BS-P：GGGGATTCCC；BS-S：TAGTAACGCC。6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述mCMV1用BS-T替代人野生型CMV启动子中的wtBS1，用BS-P替代人野生型CMV启动子中的wtBS2。7.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述mCMV2用BS-T替代人野生型CMV启动子中的wtBS1，用BS-P分别替代人野生型CMV启动子中的wtBS2和wtBS4。8.根据权利...

【专利技术属性】
技术研发人员：王进科，王丹阳，
申请(专利权)人：东南大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32