酶法制备D-酪氨酸的方法技术

本发明专利技术公开一种手性有机化合物的制备方法，尤其是一种由ＤＬ－酪氨酸制备Ｄ－酪氨酸的方法，首先将ＤＬ－酪氨酸与酰化试剂在有机酸条件下酰化反应制备Ｎ－乙酰－ＤＬ－酪氨酸，将Ｎ－乙酰－ＤＬ－酪氨酸和去离子水配制成０．５－１．０ｍｏｌ／Ｌ的溶液，用碱调节ｐＨ值，过滤后得到Ｎ－乙酰－ＤＬ－酪氨酸溶液，该溶液通过固定有Ｄ－酰化水解酶的酶柱，反应后洗脱，反应液用脱色剂脱色，过滤，浓缩，冷却，结晶，并用少量去离子水漂洗，经干燥得到Ｄ－酪氨酸，结晶母液可制备Ｌ－酪氨酸。由ＤＬ－酪氨酸酶法制备Ｄ－酪氨酸的工艺可用于大批量工业生产。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术是一种手性有机化合物的制备方法，尤其是一种由DL-酪氨酸制备D-酪氨酸的方法。
技术介绍
酪氨酸，化学名称α-氨基-β对羟苯基丙酸，又名对羟基苯丙氨酸。英文名称为Tyrosine，具有特殊的生理学性质，在食品、饲料工业以及农业中均有重要的用途。酪氨酸是一种典型的中性氨基酸，其结构中有一个手性碳原子，即氨基所在位置的碳原子，因此酪氨酸具有光学异构体，即L-酪氨酸和D-酪氨酸，对映体结构如下 L(-)-酪氨酸 D(+)-酪氨酸L-酪氨酸是一种天然氨基酸，其性能早已被人们认识，并被广泛应用于医药、食品、饲料、化工等领域。如L-酪氨酸可以作为食品、饲料的添加剂，在医药行业可以作为复合氨基酸输液的原料。D-酪氨酸是一种非天然氨基酸，过去一直被人们认为是无用的，所以对其性能和作用研究只是近年才开始，尤其是随着科学研究的不断深入，人们发现D-酪氨酸具有独特的生理性能，在生命活动和药物制备中具有L-酪氨酸所不能替代的作用。目前，D-酪氨酸已经发展成为一种具有广泛应用前景的手性源，即可以作为手性前体合成一系列手性药物，而且这些手性药物具有一些特殊的功效。例如，以D-酪氨酸为前体，合成的阿托西班是重要的保胎药；合成的多肽在治疗恶性肿瘤方面有特殊疗效；合成的茴香酶素具有抗原虫、抗变形虫、抗真菌、抗肿瘤和防治植物真菌等作用；D-酪氨酸还可以用于合成治疗霉菌、酶红菌、酵母菌、寄生虫感染的抗菌药；另外，D-酪氨酸在合成对肺部、中枢神经系统、肝脏、关节、心内膜、眼、耳、皮肤、肠胃、泌尿系统炎症等疗效极好的消炎药物方面也有广泛的用途。目前，这些药物大多仍处于药理药效的临床实验阶段，若以上药物全面上市，必将促使D-酪氨酸的需求量急剧上升。统计资料显示，目前国内外还没有大规模生产D-酪氨酸的企业，主要制约因素是目前尚没有可以应用于规模化、低成本生产D-酪氨酸的技术。由此可见，研究开发D-酪氨酸制备技术是十分必要的。D-酪氨酸是一种非天然氨基酸，和L-酪氨酸不同，D-酪氨酸不能从自然界的物质中提取，只能通过手性合成或者拆分的方法得到。手性合成是制备手性化合物的重要方法之一，但是目前来说，大部分手性化合物仍然没有寻找到合适的合成方法和试剂，所以拆分法是当前最经济可行的手性化合物制备方法。由于人们对D-酪氨酸的认识较晚，对D-酪氨酸的拆分制备技术的研究也是近年才引起人们的重视。因此，迄今国外都鲜有关于D-酪氨酸的拆分制备技术的报道，国内更是少见。据调查，在已有的D-酰化水解酶中，从A.dentrifians DA181和A.faecalis微生物中提取并纯化的D-酰化水解酶，具有更高的立体选择性和光学活性，而且酶的稳定性良好、易于纯化，目前已有商品出售，因此考虑外购D-酰化水解酶拆分混旋酪氨酸制备D-酪氨酸。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种效率高、成本低、可工业化的利用酶法制备D-酪氨酸的方法。本专利技术公开的酶法制备D-酪氨酸的方法包括以下步骤a、首先将DL-酪氨酸与酰化试剂在有机酸条件下按重量比1∶1～3∶1(W)投料进行酰化反应制备N-乙酰-DL-酪氨酸；b、纯化D-酰化水解酶，用酶柱固定酰化水解酶；c、将N-乙酰-DL-酪氨酸和去离子水配制成0.5-1.0mol/L的溶液，用碱调节PH值7-8，过滤后得到N-乙酰-DL-酪氨酸溶液；d、N-乙酰-DL-酪氨酸溶液在40-60℃通过固定有D-酰化水解酶的酶柱，反应时间5-8小时；e、洗脱，反应液用脱色剂于80-90℃脱色，过滤，浓缩，冷却，结晶，并用少量去离子水漂洗，经干燥得到D-酪氨酸。结晶母液可制备L-酪氨酸。纯化的酰化水解酶是一种在工业有效的基质浓度下具有活性高、立体选择性强、抗抑制性强，只对N-乙酰-DL-酪氨酸中的N-乙酰-D-酪氨酸脱酰基合成D-酪氨酸的新型D-酰化水解酶；在酰化过程中所用的酰化试剂为醋酸酐；所用的有机酸为醋酸；调节N-乙酰-DL-酪氨酸溶液PH值所用的碱为氢氧化钠溶液或氨水；脱色过程中所用的脱色剂为吸附性的脱色剂，如活性炭或者硅藻土或者白土。本专利技术提出了由DL-酪氨酸制备D-酪氨酸的酶法新工艺，由于纯化的D-酰化水解酶在工业有效的基质浓度下具有活性高、立体选择性强、抗抑制性强的特点，使得D-酪氨酸的收率达到88％以上，D-酪氨酸产品的光学纯度大大提高，达到99.5％ee以上，降低了生产成本。在酰化过程中所用的酰化试剂和有机酸、调节酰化DL-酪氨酸溶液PH值所用的碱以及脱色过程中所用的脱色剂均为工业生产常用化工原料。综上所述，本专利技术提出的由DL-酪氨酸制备D-酪氨酸的酶法新工艺可用于工业化生产D-酪氨酸。具体实施方案DL-氨基酸在一定的条件下经酰化试剂作用进行酰化反应生成N-乙酰-DL-氨基酸，N-乙酰-DL-氨基酸在专一性酰化水解酶的作用下选择性地对其中的D-酰化氨基酸脱乙酰水解得到D-氨基酸。本专利技术中，纯化了一种活性高、抗抑制性强、对N-乙酰-D-酪氨酸具有高立体选择性的D-酪氨酸酰化水解酶，通过N-乙酰-DL-酪氨酸中的N-乙酰-D-酪氨酸脱乙酰得D-酪氨酸。实施例1步骤1制备N-乙酰-DL-酪氨酸将36.2gDL-酪氨酸(0.2mol)、24.0g醋酸(0.4mol)溶于200ml去离子水中，加入24.0g醋酸酐(0.2mol)，在40-60℃下搅拌反应3-6小时，蒸馏回收未反应的醋酸，冷却至室温后再用冰水浴冷却1小时，然后过滤、离心、洗涤、干燥得到42.6g产品，收率为95.5％。得到的N-乙酰-DL-酪氨酸备用。步骤2 D-酰化水解酶的纯化和固定化市售D-酰化水解酶菌体投加至溶解罐中(PH7.8)，用二乙氨基乙基色谱柱进行部分纯化，然后用酶柱进行固定化，在低温下贮存备用。经测试，每克湿菌体可分别产生2245活力单位的D-酰化水解酶和852活力单位的L-酰化水解酶。每毫升凝胶的固定化D-酰化水解酶含有13500酶活力单位。用N-乙酰基甲硫氨酸作底物测试时，游离酶和固定化酶的米氏常数分别为1.0和0.22。固定化酶拆分反应中PH为7.5，温度为45℃。游离酶在PH5.0-11.0范围内都比较稳定，而固定化酶在PH9.0以上易发生溶解。两种酶在40℃时都很稳定。固定化酶在45℃连续拆分20天后酶活力仍保持90％。步骤3 D-酰化水解酶拆分混旋酪氨酸制备D-酪氨酸将上述步骤1制得的42.6g N-乙酰-DL-酪氨酸溶解于300ml去离子水中，用氢氧化钠溶液调节PH值8.0。在45℃将反应液过固定化酶柱，然后用适量乙醇洗脱。洗脱液转移到三口烧瓶中，加入2g活性炭，在85℃保温搅拌40分钟，趁热过滤。滤液于60℃真空浓缩原体积的1/3，此时有大量晶体析出。于5℃-10℃冷却结晶3-6小时，离心分离母液，滤饼干燥，得D-酪氨酸产品32.5g。经检测，产品旋光度为D20＝+11.7°，光学纯度99.7％ee，酶拆分收率为94.0％。产品总收率89.8％。实施例2步骤1制备N-乙酰-DL-酪氨酸将54.3gDL-酪氨酸(0.3mol)、36.0g醋酸(0.6mol)溶于200ml去离子水中，加入24.0g醋酸酐(0.2mol)，在50-65℃下搅拌反应4-6小时，蒸馏回收未反应的醋酸，冷却至室温后再用冰水浴冷却45分钟，然后过滤、离心、洗涤、干本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种酶法制备Ｄ－酪氨酸的方法，包括以下步骤：ａ、首先将ＤＬ－酪氨酸与酰化试剂在有机酸条件下按重量比１∶１～３∶１（Ｗ）投料进行酰化反应制备Ｎ－乙酰－ＤＬ－酪氨酸；ｂ、纯化Ｄ－酰化水解酶，用酶柱固定酰化水解酶；ｃ、将Ｎ－乙酰－ＤＬ－酪氨酸和去离子水配制成０．５－１．０ｍｏｌ／Ｌ的溶液，用碱调节ＰＨ值７－８，过滤后得到Ｎ－乙酰－ＤＬ－酪氨酸溶液；ｄ、Ｎ－乙酰－ＤＬ－酪氨酸溶液在４０－６０℃通过固定有Ｄ－酰化水解酶的酶柱，反应时间５－８小时；ｅ、洗脱，反应液用脱色剂于８０－９０℃脱色，过滤，浓缩，冷却，结晶，并用少量去离子水漂洗，经干燥得到Ｄ－酪氨酸。结晶母液可制备Ｌ－酪氨酸。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：马云峰，柴多里，王组元，
申请(专利权)人：安徽省恒锐新技术开发有限责任公司，
类型：发明
国别省市：34[中国|安徽]