代谢控制的工程化制造技术

本发明专利技术特征在于在代谢物和代谢通量的调控下在细胞中生产异源分子的方法，所述方法可增加异源多肽和代谢物的合成。（*该技术在2020年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及代谢控制的工程化，更具体地涉及工程化的宿主细胞，其可以增加异源多肽和代谢物的产量，本专利技术还涉及在宿主细胞中生产异源多肽和代谢物的方法。
技术介绍
重组DNA技术的应用使得可工程化宿主细胞，以产生所需的化合物，如多肽和次生代谢物。在工程细胞中大规模生产多肽使得可生产具有药学用途的蛋白质和具有工业用途的酶。次生代谢物是来自自然界的产物，长久以来已知其生物学和医学重要性。由于这种分子固有的结构复杂性，传统的化学合成通常需要大量人力并使用昂贵的前体和辅因子以制备该化合物。近年来，在细胞中表达异源蛋白已经促进在生物中异源生物合成途径的工程化，以从非昂贵的起始材料生产代谢物。以此方式，已产生了许多化合物，包括聚酮化合物，β-内酰胺抗生素，单萜，类固醇，和芳香化合物。
技术实现思路
本专利技术部分基于如下发现，即可通过使用受次生代谢物如乙酰磷酸浓度调节的启动子调节多肽(如生物合成酶)的表达，而增加异源多肽和代谢物的产生。术语“异源”是指多肽或代谢物是通过人为导入的。异源多肽或代谢物可与天然存在的内源性物质相同。术语“代谢物”指是一或多个生物化学反应的产物的有机化合物。代谢物其自身可以是其它反应的前体。次生代谢物是产生自另一代谢物的代谢物。因此本专利技术一方面涉及一种含有一核酸序列的细菌宿主细胞，该核酸序列包含一个启动子和一个编码异源多肽的核酸序列。细菌宿主细胞例如包括大肠杆菌，枯草芽孢杆菌，鼠伤寒沙门氏菌，根瘤土壤杆菌，嗜热水生菌，和豌豆根瘤菌细胞。此核酸序列可操纵地与由应答调节蛋白控制的启动子连接。换而言之，核酸序列与启动子的连接方式是使核苷酸序列在体外或体内表达。“启动子”是指导遗传物质转录的任何DNA片段。启动子是由应答调节蛋白控制的，例如大肠杆菌的ntrC，phoB，phoP，ompR，cheY，creB，或torB，或其它细菌菌种的同源物。另外，应答调节蛋白可以是簇合直向同源组(cluster orthologous group，COG)COG0745的另一成员，其由http://www.ncbi.nlm.nih.gov/COG/所定义(Tatusov等，核酸研究(2000)；2833-36)。在一实施方案中，启动子是与大肠杆菌ntrC结合的。术语“ntrC”是指大肠杆菌ntrC蛋白(SWISSPROTP06713，http://www.expasy.ch/)及在其它适当细菌中的同源物。本文所用“结合”是指平衡结合常数(KD)小于100nM，优选小于1nM的物理缔合作用。一适当的启动子例如是大肠杆菌glnAp2启动子，如以GenBank登记号No.M10421公布的DNA序列的大约93-323位之间的区域(Reitzer & Magasanik(1985)美国科学院院报821979-1983)。此区域包括glnA基因的未翻译序列。另外，可在glnA编码序列和异源多肽的编码序列之间构建一翻译融合体。宿主细胞被遗传修饰从而启动子由乙酰磷酸在无氮饥饿的情况下调节。例如，宿主细胞可通过缺失或突变编码组氨酸蛋白激酶的基因而遗传修饰，例如，该组氨酸蛋白激酶是COG0642的成员(如由http://www.ncbi.nlm.nih.gov/COG/所述；Tatusov等，如前)，例如glnL，phoR，phoQ，creC，或envZ。在另一实施例中，组氨酸蛋白激酶对控制启动子的应答调节蛋白有特异性。组氨酸蛋白激酶可由glnL，如大肠杆菌glnL(SWISSPROT P06712，http://www.expasy.ch/)编码。尽管宿主细胞被遗传修饰从而启动子由乙酰磷酸在无氮饥饿的情况下调节，以表达异源多肽或代谢物，但宿主细胞可在任何所需条件下繁殖，例如在氮饥饿条件，氮缺乏条件，或氮富足条件下繁殖。由此核酸序列编码的异源多肽可以是产生代谢物所需的生物合成酶，其可以是哺乳动物蛋白，例如分泌的生长因子，单克隆抗体，或胞外基质组分。在另一实施例中，异源多肽可以是用于疫苗中的所需抗原，例如来自病毒，细菌，真菌或原生动物病原体的表面蛋白。本专利技术的另一方面涉及一种试剂盒，其含有一种核酸序列，该核酸序列包括由应答调节蛋白控制的启动子。此试剂盒还任选的含有已经遗传修饰的细菌宿主细胞，从而启动子在不存在氮饥饿情况下由乙酰磷酸调节。此试剂盒还可提供使用说明。所述核酸序列可含有位于启动子3’端的限制酶多接头，这样插入多接头的序列与由应答调节蛋白控制的启动子可操纵地连接。在该试剂盒的一实施方案中，启动子是大肠杆菌glnAp2启动子，细菌宿主细胞是含有glnL基因缺失或突变的大肠杆菌细胞。本专利技术另一方面涉及含有第一个表达盒的宿主细胞。第一个表达盒包括启动子，如上述那些启动子，以及编码异源代谢物生物合成所需的酶的核酸序列。本文所用术语“酶”是指具有催化一个化学反应或多个反应的能力的多肽。所述核酸序列可操纵地与启动子连接，该启动子在无氮饥饿情况下由乙酰磷酸调节。宿主细胞还含有表达代谢物生物合成所需的其它酶的另外的核酸序列。这种另外的核酸序列可以是表达内源酶的内源序列，或表达异源酶的导入的序列。在一实施例中，异源代谢物是类异戊二烯，多羟基链烷酸酯，聚酮化合物，β-内酰胺抗生素，芳香化合物，或其前体，例如上游代谢物，或其衍生物，例如下游代谢物。例如，类异戊二烯可以是类胡萝卜素，固醇，紫杉醇，二萜，赤霉素，和醌。类异戊二烯的特别例子包括二磷酸异戊酯，二磷酸二甲基烯丙酯，二磷酸香叶酯，二磷酸法呢酯，二磷酸香叶基香叶酯，和八氢番茄红素。类胡萝卜素特别例子包括β-胡萝卜素，ζ-胡萝卜素，虾青素，玉米黄质，玉米黄质-β-葡糖苷，六氢番茄红素，链孢红素，叶黄素和torulene。当所需的异源代谢物是类异戊二烯时，异源酶可以是异戊烯二磷酸异构酶，二磷酸香叶基香叶酯合酶，或1-脱氧木酮糖-5-磷酸合酶。当所需的异源代谢物是多羟基链烷酸酯时，异源酶可以是3-酮酯酰还原酶，或聚-3-羟基链烷酸酯聚合酶。宿主细胞可以是细菌细胞，例如大肠杆菌细胞。此宿主细胞任选地通过缺失或突变一个基因而遗传修饰，该基因例如是上述编码组氨酸蛋白激酶的基因。在一特异的实施例中，宿主细胞还含有第二个表达盒，其含有与受乙酰磷酸浓度调节的启动子如glnAp2可操纵连接的编码烯醇丙酮酸磷酸合酶的核酸序列。本专利技术另一方面涉及一种在宿主细胞中生产异源类异戊二烯的方法。该方法包括过表达烯醇丙酮酸磷酸合酶，和表达异源类异戊二烯合成所需的生物合成酶。在一实施方案中，在宿主细胞中编码丙酮酸激酶或烯醇丙酮酸磷酸羧化酶的基因经遗传缺失或弱化。在另一实施方案中，编码烯醇丙酮酸磷酸羧激酶的基因在宿主细胞中过表达。本专利技术的另一方面涉及一种在宿主细胞中生产番茄红素的方法，此方法包括表达以下异源酶1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶，二磷酸香叶基香叶酯合酶，八氢番茄红素合酶，和八氢番茄红素饱和酶。在此方法的一实施方案中，异戊烯二磷酸异构酶例如使用glnAp2启动子而过表达。本专利技术的另一方面涉及一种核酸序列，其含有一个启动子和编码产生第一种代谢物所需的生物合成酶的序列。该启动子可操纵地与该序列连接，并由第二种代谢物调节，该第二种代谢物的浓度是生物合成第一种代谢物的前体的可用性的指示。在一实施例中，第二本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种在宿主细胞中生产异源类异戊二烯的方法，包括培养包含编码异源烯醇丙酮酸磷酸合酶的核酸序列的宿主细胞使所述的酶过表达；并在该宿主细胞中表达异源类异戊二烯合成所需的生物合成酶；以及从该宿主细胞中收获所述异源类异戊二烯。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：詹姆斯C廖，
申请(专利权)人：食品工业发展研究所，
类型：发明
国别省市：71[中国|台湾]