一种用以制造具有药理活性之樟芝（Ａｎｔｒｏｄｉａ ｃａｍｐｈｏｒａｔａ）培养物的方法，其包含： （ａ）将一樟芝分离株的菌丝体接种源接种在一适于该分离株生长的培养基中，以获得第一培养物； （ｂ）令从步骤（ａ）培养而得之第一培养物接受被设定在第一预定速率下的第一振荡阶段，历时一段可令被接种之分离株进一步生长的时间，以获得一增殖有菌丝体的第二培养物；以及 （ｃ）令得自于步骤（ｂ）之第二培养物接受被设定在不同于第一预定速率之第二预定速率下的第二振荡阶段，令该分离株处于生理压力下。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及建立一种适于从一樟芝(Antrodia camphorata)培养物中大规模地制造出具药理活性之滤出物的培养条件，具体地，该培养条件是藉由令培养期间的振荡速率及/或pH值最佳化来建立。本专利技术亦涉及一种经由一系列部分分离过程而从一樟芝培养物中获得具药理活性之组合物的方法。本专利技术亦涉及利用前述组合物来制备药学组合物。在台湾民俗医学上，樟芝的子实体被认为对于中毒、腹泻、腹痛、高血压、皮肤搔痒及肝癌所引起的症状具有某种医药功效。然而，由于严苛的宿主专一性(host specificity)与在自然界中的稀有性，以及在人工栽培上的失败，所以「牛樟芝」在市面上极为昂贵。无疑地，发展出大规模人工培养此种真菌的低成本制法是极具产业价值的。目前，本案专利技术人已发现樟芝于浸没式发酵培养时可展现出所希望的药理活性，特别是抗肿瘤活性。如美国专利申请案第09/566,834号所揭露者，樟芝已被成功地小规模培养于诸如马铃薯右旋糖培养液(PDB)以及含有果糖作为主要碳源的合成培养基内。利用杭特氏座标系(Hunter′s coordinate system)进行测量，所得培养物显现出红色度指标为a≥3的暗红色外观，而此色泽与对于某些肿瘤细胞品是之生长的显着抑制效应相关。更重要的是，作用于肿瘤细胞的活性成份虽然仍未被鉴定出，但已被发现能从真菌菌丝体分泌至培养物之液相中，使得从培养物中能轻易地获取具药理活性之组合物，以供产业利用。因此，若此一有利之方法能被最佳化以供用于大量制造真菌培养物，当是极为希望的。更优选为针对一希望药理活性来部分分离粗制滤出物，以获得富含所希望活性的有用组合物。因此，本专利技术之第一实施方案是提供一种用以制造具有药理活性之樟芝培养物的方法，其包含(a)将一樟芝分离株的菌丝体接种源接种在一适于该分离株生长的培养基中，以获得第一培养物；(b)令从步骤(a)培养而得之第一培养物接受被设定在第一预定速率下的第一振荡阶段，历时一段可令被接种之分离株进一步生长的时间，以获得一增殖有菌丝体的第二培养物；以及 (c)令得自于步骤(b)之第二培养物接受被设定在不同于第一预定速率之第二预定速率下的第二振荡阶段，令该分离株处于生理压力下。依据本专利技术之第二实施方案，其是提供一种用以制造具有药理活性之樟芝培养物的方法，其包含(a)将一樟芝分离株的菌丝体接种源接种在一适于该分离株生长的培养基中；以及(b)将得自于步骤(a)之培养物予以培养，藉由在整个步骤(b)期间将培养物之pH值调整至pH4.5至5.4的范围内。优选地，樟芝培养物的pH值在整个步骤(b)期间被调整至pH4.6至5.3之范围内，且更优选为pH4.7至5.2之范围内。本专利技术亦提供一种用以获得一系列液态分离部分的方法，该等分离部分是针对一诸如抗肿瘤活性的希望药理活性而从樟芝培养物中分离出。因此，本专利技术之第三实施方案是提供一种用以从樟芝培养物获得一具有药理活性之组合物的方法，其包含(a)将一樟芝分离株的菌丝体接种源接种在一适于该分离株生长的培养基中；(b)将步骤(a)所得之培养物予以培养；以及(c)从该培养物中移除大部分的不溶性物质，从而获取一具有药理活性的溶液；以及(d)将步骤(c)所得之溶液予以处理，以获得含有分子量不超过约10kDa之真菌分子的药理活性组合物。优选地，所获得之组合物含有具分子量不超过约3kDa且更优选为不超过约1kDa之真菌分子。本专利技术之第四实施方案是提供一种用以从樟芝培养物获得具有药理活性之组合物的方法，其包含(a)将一樟芝分离株的菌丝体接种源接种在一适于该分离株生长的培养基中；(b)将步骤(a)所得之培养物予以培养；(c)从该培养物中移除大部分的不溶性物质，从而获取一具有药理活性的溶液；(d)将步骤(c)所得之溶液予以处理，以获得含有分子量不超过约1kDa之真菌分子的分离部分；以及(e)令步骤(d)所得之分离部分通过一水不混溶相，并从该水不混溶相获得该具药理活性的组合物。前述步骤(e)中之水不混溶相是优选为一含有有效量之吸附剂的固定相，该吸附剂能选择性地吸附疏水性真菌分子。将该固定相予以洗脱，以获得具有药理活性的分离部分。在本专利技术一个优选实施方案中，令步骤(e)所得之洗脱物进一步接受逆相分配层析，如在LichrosorbR RP-18柱(Merck)中进行，以获得数个具有药理活性的分离部分。本专利技术更提供数种药学组合物，以供治疗癌症或肿瘤疾病，该等药学组合物含有依据本专利技术之任一方法所得的产物。本专利技术更提供一种用以在需治疗之病人体内治疗癌症或肿瘤疾病的方法，该方法是藉由将一个含有依据本专利技术之任一方法所得之产物的组合物处方给该病人。图4显示出源自于放大规模樟芝培养物之滤出物的抗肿瘤活性；图5为一流程图，其显示出一樟芝滤出物针对分子量进行纯化的流程；图6为一柱状图，其显示依据图5所分离出之培养物滤出物的抗肿瘤活性，其中受测细胞株包括有MRC-5、HeLa、AGS、Hep G2以及MCF-7；图7为一柱状图，其将以AmberliteR XAD-4从一滤出物分离部分所分离出之分离部分的抗肿瘤活性予以比较，该滤出物分离部分含有分子量不超过约1kDa之真菌分子，其中受测细胞株包括有MRC-5、HeLa、AGS、Hep G2以及MCF-7；图8为图7之乙酸乙酯洗脱物在一个LichrosorbR RP-18柱中进行部分分离的光谱曲线；以及图9-11显示图8中所分离出数个分离部分的抗肿瘤活性。在本说明书中，「适合之培养基」此用语意指任何可以提供适于樟芝生长之人工环境并维持其药理活性的培养基。优选地，本专利技术所使用之培养基适于促使菌丝体中生成具药理活性之物质，并促使该(等)物质分泌至胞外。适用于本专利技术之培养基包括被称为「马铃薯右旋糖培养液(potatodextrose broth)」的天然培养基，以及任何含有果糖作为主要碳源的合成培养基。马铃薯右旋糖培养液可藉由诸如将一由300.0克切成丁状之马铃薯、20.0克右旋糖与1.0升蒸馏水所构成的混合物予以湿热灭菌，而在实验室中制备，抑或是购自于诸如DIFCO等商业来源。最佳之培养基为任何含有果糖作为主要碳源的合成培养基。若有需要，葡萄糖、蔗糖、半乳糖、果糖、玉米淀粉及麦芽萃出物等其他碳源以及此等之组合亦可被囊括于合成培养基中，以作为助剂。优选地，以该合成培养基之总体积为基准，该碳源优选在1.5至2.5重量％之范围内，且更优选为呈1.5至2重量％之含量。除了碳源以外，合成培养基可包含有氮源、微量元素(诸如无机盐)，以及任选之维生素或其他生长因子。氮源包括但不限于硫酸铵、硝酸铵、硝酸钠、酪蛋白氨基酸(casamino acid)、酵母膏、蛋白胨(peptone)及胰胨(tryptone)以及此等之组合。优选地，依据本专利技术，该合成培养基是含有酵母膏作为氮源。以该合成培养基之总体积为基准，该氮源优选在0.2至2.0重量％之范围内，且更优选为呈0.5重量％之含量。依据本专利技术，任何可得之樟芝分离株均可供用于培养方法中，只要所使用之微生物具有生成可检测量之具药理活性代谢物的能力。可供使用之樟芝分离株包括有但不限于CCRC 35396(1994年12月1日被寄存于食品工业发展研究所(台湾新竹市)之菌种保存及研究中心(CCR本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：吴美娇，黄仁彰，林锡杰，王伯彻，
申请(专利权)人：食品工业发展研究所，
类型：发明
国别省市：
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