本方法公开了一种利用醋酸杆菌(Acetobacter sp.CGMCC NO.8142)静息细胞及其固定化细胞生物转化丙烯醛为丙烯酸的方法，属于生物工程和酶工程领域。本发明专利技术的创新之处在于微生物培养方法简单，转化效率高，转化液成分简单，利于产品分离纯化，反应条件温和，节约大量的能源和生产成本。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及应用一株醋酸杆菌菌株静息细胞及其固定化细胞转化丙烯醛为丙烯酸的方法，属于生物工程和酶工程领域。
技术介绍
丙烯酸(Acrylic acid)，是工业生产中重要的不饱和有机酸，也是重要的有机原料，其分子中有特殊的双键结构和酸性官能团。丙烯酸及其衍生物具有无色透明，有粘性、弹性，不易风化等优点，用于生产粘合剂、涂料、化纤、光敏树脂板等化工产品。我国在生产高吸水树脂、丙烯酸酯等领域对丙烯酸的需求逐年增加，丙烯酸的生产越来越受到重视。目前丙烯酸的生产主要有化学法、微生物发酵法和生物转化法。丙烯酸主要通过化学法从石油中获得。工业化生产中大多采用丙烯氧化法，分为两个阶段:首先将丙烯氧化成丙烯醛，再进一步氧化为丙烯酸。丙烯氧化法具有原料价格低廉、回收率高等优点，在丙烯酸的生产中占有主导地位。微生物发酵法主要是通过基因工程的方法构建工程菌，其主要的策略为在丙酸梭菌厌氧发酵过程中，乳酸可以转化为丙烯酸。但是发酵法具有产量低、菌种不稳定、生产周期长、产物提纯过程繁琐、转化率低、产品纯度低、含等不足。有研宄发现含有腈水合酶的红球菌能够利用全细胞将丙烯腈氧化催化为丙烯酸，但转化率仅为63%。John等进行了 Rhodococcus AJ270的固定化和利用包埋生物催化剂来生产丙烯酸的研宄，成功地将丙烯酰胺催化成丙烯酸，得到了较高的转化率，但由于丙烯酰胺的成本较高，很难实现工业化生产。本专利技术的创新之处在于利用一株醋酸杆菌(Acetobacter sp.)静息细胞高效转化丙烯醛为丙烯酸的方法，具有微生物培养工艺简单、转化效率高、产物产量大、转化液成分简单利于产品分离纯化、转化过程可以人为地调节菌体浓度以缩短生产时间，节约大量的能源和生产成本，利于推广。
技术实现思路
本专利技术要解决的问题是提供一种利用醋杆菌生物转化丙烯醛为丙烯酸的方法，利用所述醋杆菌静息细胞及其固定化细胞，以丙烯醛为底物进行生物催化反应生产丙烯酸，具体步骤如下:(I)菌株的培养:发酵培养基:甘油20，甘露醇5，酵母膏5，蛋白胨1，硫酸铵2，硫酸镁10，磷酸二氢钾1，pH 6.0 ;培养温度30°C ;摇床转速200RPM ;培养时间32h，将发酵液离心获得菌体。(2)催化反应体系的建立:菌体用适当的缓冲液配制成一定pH(6_8)的悬浮液，菌体浓度5-20g/L，加入终浓度为5-20g/L的丙烯酸，进行催化反应，催化温度20_40°C，摇床转速220RPM，催化时间15-120min。所述缓冲液可以为磷酸氢二钾-磷酸二氢钾缓冲液；所用缓冲液体系浓度为0.lmol/L ；pH 6-8。(3)醋杆菌细胞的固定化:菌体经过32h培养后离心洗涤3次，倾去上清，与4%海藻酸钠溶液以1:1?4的比例混合，注入0.05mol/L的CaCl2溶液中，固定化12h。本专利技术的有益效果:本专利技术利用醋酸杆菌(Acetobacter sp.CGMCC N0.8142)及其固定化细胞在水相体系中高效的转化丙烯醛为丙烯酸，在5-10g底物浓度范围内，产物的转化率高达91 %，该方法培养工艺简单、转化效率高、转化液成分简单利于产品分离纯化、产物产量大、转化过程可以人为地调节菌体浓度以缩短生产时间，节约大量的能源和生产成本。【附图说明】图1:丙烯酸标样液相色谱图图2:静息细胞转化产物液相色谱图图3:丙烯酸标样质谱图图4:静息细胞转化产物质谱图【具体实施方式】实施例1 Acetobacter sp.转化丙稀醛为丙稀酸能力的鉴定将筛选得到的单菌落接入种子培养基(50mL/250mL)中，30°C，220RPM培养16h后，以10%的接种量接入发酵培养基中，30°C，220RPM培养36h后，离心获得菌体，将菌体用pH6.0的磷酸盐缓冲液洗涤两次后，用pH6.0的磷酸盐缓冲液将菌体悬浮，制成菌体浓度1g/L的菌悬液，加入一定量的底物丙烯醛，使其终浓度为15g/L，在30°C，220RPM下催化60min内取样，转化液经离心去除菌体，0.22um的水相滤膜过滤后进行HPLC和质谱检测。经过HPLC检测得到丙烯酸标准品的出峰时间在9.764min左右(附图1)，转化液经HPLC在相同条件下检测发现中存在很明显的峰，出峰时间在9.756min左右(附图2)，与标准品出峰时间很吻合。将3-羟基丙酸的标准品与转化液进行ES1-MS检测，比较质朴图发现两者存在相同的m/z = 71特征峰(附图3、4)由此可以判断筛选得到的菌株具有转化丙烯醛为丙烯酸的能力。实施例2 Acetobacter sp.静息细胞催化丙稀醛产丙稀酸将培养32h的菌体离心洗涤后，分别用pH 6.0，6.4，6.8，7.2，7.6，8.0的0.1mmol/L的磷酸盐缓冲液将菌体制成5g/L，10g/L，15g/L，20g/L的菌悬液，加入丙烯醛至终浓度分别为 5g/L，10g/L，15g/L，20g/L，在 30°C，220RPM 下催化 90min，反应产物经 HPLC 检测，在 pH6.8，菌体浓度为10g/L时其产量达到10.32g/L、转化率为80%。实施例3 Acetobacter sp.固定化细胞催化丙稀醛产丙稀酸将Acetobacter sp.细胞在培养基中培养32h后经离心洗涤，与0.05mol/L的海藻酸钠溶液以1:1?4的比例混合，分别加入pH 4.8,5.2,5.6,6.0的0.2mmol/L的醋酸钠-醋酸缓冲液，使菌体浓度为10g/L，在30 °C，220RPM摇床转速下反应90min。经HPLC检测发现，当离心后的菌体与海藻酸钠溶液比例为1:1，PH 6.0时丙烯酸产量最高，为11.51g/L，转化率为90%。实施例4 Acetobacter sp.固定化细胞的重复利用在30°C条件下，将10g/L固定化细胞在pH 6.0的0.2mmol/L的醋酸-醋酸钠缓冲液体系中与10g/L丙稀醛反应，每90min收集固定化颗粒，在相同条件下重新与10g/L丙稀醛反应，经HPLC检测，4次重复利用后，丙烯酸的产量为8.49g/L，转化率高达75%。虽然本专利技术已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本专利技术，任何熟悉此技术的人，在不脱离本专利技术的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本专利技术的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。【主权项】1.一种利用醋杆菌(Acetobacter sp.)高效生物转化丙稀醛生产丙稀酸的方法，其特征在于，收集培养后的微生物菌体，以其静息细胞或固定化细胞为生物催化剂，以丙烯醛为底物进行催化反应生产丙烯酸。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，具体步骤如下: (1)醋杆菌的培养:在30°C条件下，将醋酸菌在培养基中培养32h; (2)静息细胞催化反应:将发酵培养32h的菌体离心洗涤后制成一定浓度的菌悬液，加入丙烯醛，在20-40 °C和220RPM摇床转速下催化15_120min，反应完成后进行HPLC检测。 (3)固定化细胞反应:将离心后的菌体用海藻酸钠溶液包埋，制成固定化醋杆菌颗粒，在缓冲体系中进行催化反应并用HPLC检测。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述发酵培养基的碳源为甘油20g/L，甘露醇 5g/L，酵母膏 5g/L，蛋白胨 lg/L，(NH本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种利用醋杆菌(Acetobacter sp.)高效生物转化丙烯醛生产丙烯酸的方法，其特征在于，收集培养后的微生物菌体，以其静息细胞或固定化细胞为生物催化剂，以丙烯醛为底物进行催化反应生产丙烯酸。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：诸葛斌，王旭昌，宗红，陆信曜，宋健，方慧英，诸葛健，党艺文，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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