一种RAX2基因的靶向抑制剂及其用途制造技术

本发明专利技术属于医药技术领域，具体涉及一种RAX2基因的靶向抑制剂及其用途。一种RAX2基因的靶向抑制剂，该靶向抑制剂的基因序列为：5’‑GGAGGAACCGCACCACCTTCATTCAAGAGA‑3’（SEQ ID No.1）。该抑制剂可与RAX2基因特异性结合，使RAX2基因沉默，从而抑制RAX2对胶质瘤细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响，诱导胶质瘤细胞凋亡，达到治疗胶质瘤的目的。

A target inhibitor for RAX2 gene and its use

【技术实现步骤摘要】
一种RAX2基因的靶向抑制剂及其用途
本专利技术属于医药
，具体涉及一种RAX2基因的靶向抑制剂及其用途。
技术介绍
神经胶质瘤是中枢系统最常见的恶性肿瘤，占原发性脑肿瘤的50%-60%。目前治疗手段主要以手术为主，放化疗为辅助治疗。但是，由于胶质瘤具有侵袭性生长的生物学特征，并且胶质瘤级别越高，侵袭性越强，手术即使达到影像学和显微镜下全切，复发还是在所难免。目前主流的手术加术后同步放疗后统计显示其中位生存期仅为12个月，5年生存率不足13%。高级别神经胶质瘤预后更差，如多形性胶质母细胞瘤（Glioblastomamultiforme,GBMs）的疗效仍然很差，生存中位数仍然不超过15个月。为了提高治疗的有效性，解决其复发以及治疗抵抗的问题，从基因与分子水平上研究神经胶质瘤的发病机制，寻找新的生物标志和治疗靶点显得尤为的重要。转录因子RAX2（retinaandanteriorneuralfoldhomeobox2,RAX2）定位于染色体19p13.3，由三个外显子组成，可与蛋白物质协同作用并招募参与转录机制的其他蛋白共同作用和激活转录过程。RAX2的突变与视网膜营养不良相关。软件预测BDNF-AS的Alu元件和RAX2mRNA的3’-UTR的Alu元件存在结合位点。但是，目前关于转录因子RAX2在胶质瘤中的表达和作用仍尚未见报道。RNA干扰技术的原理是利用Dicer酶切割RNA分子，形成RNA沉默复合体，靶向结合目标RNA分子进而降解RNA分子的过程。本专利技术希望利用RNA干扰技术研制RAX2基因的抑制剂，在胶质瘤基因治疗领域发挥作用。目前，RAX2在胶质瘤发生发展中的作用以及相关机制还未见报道，关于RAX2在胶质瘤基因治疗方面的应用目前还一片空白。因此，研制一种RAX2相关的药物成为目前亟待解决的问题。
技术实现思路
本专利技术人经实验证明RAX2基因在胶质瘤在组织中高表达，抑制RAX2的表达能够抑制胶质瘤细胞增殖、迁移和侵袭能力，并促进其凋亡。本专利技术的目的在于利用RNA干扰技术，设计并提供一种RAX2基因靶向抑制剂及其用途，该抑制剂可与RAX2基因特异性结合，使RAX2基因沉默，从而抑制RAX2对胶质瘤细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响，达到治疗胶质瘤的目的。为了实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案：本专利技术提供了一种RAX2基因的靶向抑制剂，该靶向抑制剂的基因序列为：5’-GGAGGAACCGCACCACCTTCATTCAAGAGA-3’（SEQIDNo.1）本专利技术进一步提供了该靶向抑制剂能够抑制RAX2基因表达的shRNA序列，所述shRNA模板序列包括正义链和反义链，所述正义链和反义链分别为：正义链：5’-CACCGGAGGAACCGCACCACCTTCATTCAAGAGATGAAGGTGGTGCGGTTCCTCCTTTTTTG-3’（SEQIDNo.2）反义链：5’-GATCCAAAAAAGGAGGAACCGCACCACCTTCATCTCTTGAATGAAGGTGGTGCGGTTCCTCC-3’（SEQIDNo.3）。进一步地，本专利技术提供了一种转录上述的shRNA的转录产物，序列为：5’-GGAGGAACCGCACCACCTTCATTCAAGAGATGAAGGTGGTGCGGTTCCTCCTT-3’（SEQIDNo.4）。优选的，该抑制剂为任何药物治疗学上可接受的的剂型。优选的，该抑制剂的剂型为注射制剂。优选的，该抑制剂为任何药物治疗学上可接受的的剂量。一种RAX2基因抑制剂作为制备用于治疗人脑胶质瘤药物中的应用。与现有技术相比，本专利技术具有如下技术效果：1、本专利技术靶向抑制剂特异性强，抑制RAX2基因的表达。2、RAX2基因抑制剂靶向治疗，能显著降低传统治疗药物的耐药问题。3、实验已证明在体外细胞学水平上应用，治疗效果确切，无不良反应发生。附图说明图1为应用Real-timePCR检测RAX2基因在正常脑组织和不同级别胶质瘤组织中的表达水平图。图2.为应用Westernblot实验检测RAX2基因在正常脑组织和不同级别胶质瘤组织中的表达水平的电泳图和柱状图。图3为应用Real-timePCR检测应用RAX2基因靶向抑制剂后，U87、U251胶质瘤细胞中的RAX2表达水平显著下调的柱状图。图4为CCK-8细胞活力法检测应用RAX2基因抑制剂后，显著抑制U87、U251胶质瘤细胞增殖的柱状图。图5为Transwell细胞迁移实验检测应用RAX2基因抑制剂后，显著抑制U87、U251胶质瘤细胞迁移的照片和统计图。图6为Transwell细胞侵袭实验检测应用RAX2基因抑制剂后，显著抑制U87、U251胶质瘤细胞侵袭能力的照片和统计图。图7为应用流式细胞仪，应用RAX2基因抑制剂后，U87、U251胶质瘤细胞凋亡显著增加的照片和柱状图。具体实施方式本专利技术主要技术方案是。1.Real-timePCR2.Westernblot3.shRNA的设计和干扰载体的制备2.干扰效率的验证3.细胞增殖实验4.细胞迁移、侵袭实验5.流式细胞仪检测细胞凋亡实验实施例1一、不同级别（I\II\III\IV级）胶质瘤细胞的制备人胶质母细胞瘤细胞系U87和U251购自上海研究院生命科学细胞资源中心，培养基使用的都是含10%血清、100U/ml盘尼西林和100µg/ml链霉素的DMEM高糖培养液或F12高糖培养液，培养环境是含有5%C02且湿润的37℃恒温培养箱。二、实时定量PCR检测RAX2基因在正常脑组织和不同级别胶质瘤组织中的表达水平。（1）Trizol法提取细胞中的总RNA。用冷PBS洗涤收集的细胞，加入1mlTrizol试剂吹打数次，镜下观察细胞成油滴状（充分裂解），后移入1.5mlEP管中，静置5分钟，使其充分裂解；向样品中加入0.2ml氯仿，手动剧烈震荡室温下静置3分钟；于4℃12000g离心15分钟，取上层水相到新的EP管中，再加入0.5ml异丙醇，上下颠倒混匀，室温下静置10分钟；4℃12000g离心15分钟后弃上清，加入1ml75%乙醇；4℃7500g离心5分钟，干燥15分钟后加入40μlDEPC水，样品可冻存于-80℃冰箱。（2）一步染料法qRT-PCR检测RAX2的表达：测定CT值，以GAPDH为内参照，以2-△△Ct表示RAX2的相对表达量。检测RAX2基因在正常星形胶质细胞和不同级别胶质瘤细胞中的表达水平，结果如图1所示，RAX2基因在胶质瘤细胞中的表达显著上调。二、Westernblot检测RAX2基因在正常脑组织和不同级别胶质瘤组织中的表达水平。(1)收集细胞，加入RIPA蛋白裂解液，震荡摇匀，冰上静置30min,4°C条件下12000g离心30min；(2)获得并收集上清并采用BCA法测定样品的蛋白浓度；(3)取40mg蛋白与5x上样缓冲液混合(1:4)，煮沸5min变性；(4)将变性蛋白加入8-10%不等的SDS变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离；(5)转膜：电压100V，电流120mA,90min-200min；(6)5%脱脂牛奶封闭2h；(7)一抗稀释液以一定比例稀释相关抗体封膜，4°C过夜；(8)TTBS洗5min，3次，加相应二抗，室温摇床上孵育2h；(9)ECL发光，照相，quanti本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种RAX2基因的靶向抑制剂，其特征在于，该靶向抑制剂的基因序列为：5’‑GGAGGAACCGCACCACCTTCATTCAAGAGA‑3’（SEQ ID No.1）。

【技术特征摘要】
1.一种RAX2基因的靶向抑制剂，其特征在于，该靶向抑制剂的基因序列为：5’-GGAGGAACCGCACCACCTTCATTCAAGAGA-3’（SEQIDNo.1）。2.根据权利要求1所述的一种RAX2基因的靶向抑制剂，其特征在于，该靶向抑制剂能够抑制RAX2基因表达的shRNA序列，所述shRNA模板序列包括正义链和反义链，所述正义链和反义链分别为：正义链：5’-CACCGGAGGAACCGCACCACCTTCATTCAAGAGATGAAGGTGGTGCGGTTCCTCCTTTTTTG-3’（SEQIDNo.2）；反义链：5’-GATCCAAAAAAGGAGGAACCGCACCACCTTCATCTCTTGAATGAAGGTGGTGCGGTTCCTCC-3’（SEQ...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘云会，薛一雪，蔡恒，刘啸白，郑健，巩威，李振，赫倩茹，马珺，刘丽波，王萍，李志清，王振华，商秀丽，苏瑞，
申请(专利权)人：中国医科大学附属盛京医院，
类型：发明
国别省市：辽宁,21