愈伤材料及其保存方法技术

本发明专利技术提供了对被培养的哺乳动物上皮细胞或间质细胞进行保藏的方法及其产物。该方法包括对上皮细胞用含有低温保藏量的单糖和／或二糖的溶液进行预处理。然后将被处理过的细胞以最小体积的溶液进行冷冻、干燥、或冷冻干燥以备后用。本发明专利技术避免使用将所述组织用于伤口之前必须清洗掉的物质。本发明专利技术还可以使上皮组织以干燥状态被保存。（*该技术在2015年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及被培养的上皮细胞的低温保藏方法以及相关的产物。本专利技术的技术背景动物细胞技术的重大成就之一是建立了低温保藏活细胞和组织，从而增强了对有价值的物质的长期保藏。由于有了低温保藏，对于生物材料例如1)有限存活的分离组织，2)临床和实验室所需要的作为细胞来源的各种组织的有限供应等所伴随着的技术和操作困难都被减低或避免了。从这个观点看，发展和建立活细胞及组织的保藏方法具有对移植所用的各种细胞和组织十分重要的作用。在早期的低温保藏，既对于成功地应用甘油在冷冻过程中避免细胞受损进行的报道(Polge et al，1949，Nature 164666)之后，又有多种的保藏细胞和组织结构、存活性和代谢的方法和策略被进行过尝试。细胞和组织的保藏方法包括专用等渗缓冲液，专用融化程序，使用低温保藏试剂，使用缓慢、快速或超速冷冻技术的方法，并按照一定顺序以防止用其它方法所无法避免的由于操作而对活样品的损伤。总体而言，在使用冷冻方法时，对组织造成损伤的主要原因之一是相的改变(从液体变为晶状固体水)，因为在形成冰的同时，伴随有电解质和pH值的改变，脱水以及其它尚不清楚的因素。这些有害作用已经通过添加低温保藏试剂和采用严格控制的冷冻程序而被降低。低温保藏可分为两类。一类是透过细胞膜并降低细胞内的水浓度(例如，甘油，二甲亚砜(DMSO)，以及单糖如甘露糖，木糖，葡萄糖，核糖和果糖)。另一类是非穿透性试剂，其作用机制尚不清楚。一般使用的这类非穿透性低温保藏制剂包括聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，羟基乙基淀粉(HES)，二糖(例如蔗糖)，以及糖醇(多元醇如甘露糖醇)。最近，已经出现了结合穿透性及非穿透性试剂的冷冻程序。对被分离的细胞的冷冻，一般都使用甘油和二甲亚砜作为主要低温保藏剂(Coriell，I.L，1979，Methods in Enzymoloty LVIII，pages29-36；Doyle et al，1994，Cell&Tissue Culture；Laboratory Procedures，J.Wiley&Sons，pages 4C1.1-4C2.4)。动物胚胎也已经被成功地保藏于存在甘油的条件下(Whittingham et al.1972，Science 178411-414；Niemann et al，1993，Mol.Reprod.Develop.36232-235)。另一方面，干燥和冻干技术只在对于保藏除哺乳动物活细胞和组织以外的其它生物材料时产生优异效果。例如，冷冻干燥技术现在被广泛用于蛋白质，蛋白质混合物以及细菌的保藏。第一次将冷冻干燥技术用于保藏哺乳动物的细胞和组织的尝试没有获得成功(GreavesR.I.N.，1960，Ann.N.Y.Acad.Sci.85723-728)。最近发现的活体对完全脱水所采用的生物化学机制(Crowe&Madin，1975，J.Exp.Zool.193323-334；Womersley&Smith，1981，Comp.Biochem.Physiol.70B579-586；reviewed by Womersley，1981，Comp.Biochem.Physiol.70B 679-678)或者对冷冻所采用的生物化学机制(Constanzo et al，1993，J.Exp.Zool.181245-255；King et al，1993，Am.J.Physiol.265R1036-R1042；Karow et al，1991，BioScience 41155-160；Storey，1990，Am.J.Physiol.258R559-R568)都对哺乳动物细胞和组织的保藏方法提出了新的建议。具信，糖类(例如，海藻糖，乳糖，麦芽糖，纤维素二糖，蔗糖，果糖等)以及多元醇(例如，山梨醇和肌醇)可能提供对脱水的防护(Womersley&Smith，supra)和对冷冻的忍耐(Storey&Storey，1988，Physiol.Rev.6827-84)，其中的一部分作用是替换细胞膜周围的水分(Crowe et al，1984，Arch.Biochem.Biophys.232400-407；Crowe et al，1984，Biochem.Biophys.Acta 769141-150)。在脱水抗性和冷冻忍耐性中所涉及的糖类中，最具有意义的是葡萄糖。这种在脊椎动物细胞代谢中具有极端重要作用的单糖，在很多种蟾蜍的冷冻忍耐性中显示出扮演着重要的角色(Kinget al，1993，supra；Constanzo et al，1993，supra；Storey&Storey，1988，supra)。从冷冻忍耐性实验中获得的数据指出，在这些动物的冷冻过程中，1)葡萄糖在血液中的浓度显著提高；2)葡萄糖在由于冷冻造成的缺氧和局部缺血的状态中可能起着能源的作用；3)葡萄糖可能起着代谢抑制物的作用(Srorey&Storey，1988，supra)。蔗糖已经被用作角膜组织保藏中低温保藏液的成分之一(Madden et al，1993，Cryobiology 30135-157；Rich&Armitage，1991，Cryobiology 28159-170；MeCarey et al.，1973，Cryobiology 10298-307)，以及被使用在胚胎组织的冷冻保藏中作为低温保藏液的成分之一(Isachenko等，1993，Cryobioloy 30432-437)。此外，葡萄糖和其它的糖类已经被用于血红细胞的冷冻干燥中(Goodrich等，美国专利第4,874,690、5,171,661和5,178,884号)。然而，血红细胞的保藏不需要维持各种组织的结构形状，而这种结构是用于移植的组织必须具有的。在上述方法中，血红细胞的存活性仅用定量性红细胞溶解，血小板收复，或糖酵解酶的检测来确定(见Goodrich等的美国专利第4,874,690和5,178,884号)，但是，没有被用与细胞整体性和组织结构性相关的参数来确定，例如，蛋白质合成和分泌。Green和其同行描述了培养人上皮角化细胞的方法(Rheinwald&Green，1975，Cell 6331-343)，该方法已经被扩展应用到其它上皮细胞的培养中。在这样的培养条件下，获得了成层的适用于对大面积烧伤、溃疡、和其它皮肤创伤进行移植的上皮细胞层(Gallicoet al.1984，New Eng.J.Med.311448-451；Heighten et al，1986.J.Am.Acad.Dermatol.14399-405)。通过这种方法获得的经过培养的上皮细胞也已经被用作临时愈伤材料(T.J.Phillips et al.，1989，J.Am.Acad.Derm.21191；Bolivar-Flores et al.，1990，Burns 163-8)，上皮细胞培养物已经成为人体表面再造的强有力的工具之一，但是，它们的有限的存活生命期限制了它们在距离生产设施并不本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种可移植的组织，包括： 被胞外物质包围着的被培养的哺乳动物上皮细胞或间质细胞，其中所述的胞外物质含有低温保藏量的单糖或二糖。

【技术特征摘要】
...

【专利技术属性】
技术研发人员：瓦利德库里哈丘齐，费德科卡斯特罗墨洛来多，路易斯萨拉查奥利沃，梅沙马施摩瑞诺，
申请(专利权)人：塞莱顿科学有限公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]