具有天然样构象的氧化还原可逆HCV蛋白制造技术

本发明专利技术涉及ＨＣＶ蛋白，其中半胱氨酸残基在纯化过程中受到可逆保护。最终，此纯化程序产生具有生物活性和天然样蛋白构象的ＨＣＶ蛋白，呈递相应的表位。本发明专利技术还涉及使用这些ＨＣＶ蛋白的药物筛选方法以及诊断和治疗应用，如疫苗和药物。（*该技术在2020年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及HCV蛋白，其中半胱氨酸残基在纯化过程中受到可逆保护。最终，此纯化程序产生具有生物活性和天然样蛋白构象的HCV蛋白，呈递相应的表位。本专利技术还涉及使用这些HCV蛋白的药物筛选方法以及诊断和治疗应用，如疫苗和药物。
技术介绍
丙型肝炎病毒(HCV)感染在发达国家和发展中国家都是一个主要的健康问题。据估计，世界人口的1-5％受此病毒影响，HCV感染似乎是输血相关肝炎的最重要原因，时常发展为慢性肝损害。而且，有证据表明HCV可诱导肝细胞癌。因此，对于可靠的诊断方法和有效的治疗制剂便有很高的需求。对于HCV污染血制品的敏感且特异的筛选方法及HCV培养方法的改进也很必需。HCV是正链RNA病毒，含有约9600个碱基，编码至少3个结构蛋白和6个非结构蛋白。按照序列同源性，结构蛋白从功能上分为1个单一的核心蛋白和两个包膜蛋白E1和E2。E1蛋白由192个氨基酸组成，依HCU基因型不同包含5-6个N一糖基化位点。E2蛋白由363-370个氨基酸组成，依HCV基因型不同包含9-11个N一糖基化位点(综述参见Major和Feinstone，1997；Maertens和Stuyver，1997)。E1蛋白包含多种可变区(Maertens和Stuyver，1997)，而E2蛋白则包含3个高变区，其中主要区域位于蛋白的N端(Maertens和Stuyver，1997)。这些包膜蛋白可通过重组技术从大肠杆菌、昆虫细胞、酵母细胞和哺乳动物细胞获得。NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B是非结构(NS)蛋白。NS3约70kDa，具有蛋白酶和螺旋酶活性。NS3中螺旋酶活性的关键序列同时还具有RNA结合、Mg++结合和ATP结合特性。抗-NS3抗体通常首先出现在血清转化系列中。在当今各种可以买到的测定方法中，NS3蛋白的免疫反应性似乎不同。迄今为止，已证实接种抗疾病的疫苗是控制疾病最经济有效的方法。然而，开发有效的HCV疫苗的努力却遇到重重困难。疫苗的一种功有是诱导病人体内免疫反应。因而，应当识别HCV抗原决定簇，并以恰当方式给予病人。抗原决定簇可被分为至少两种形式，即线性表位和构象表位。构象表位来自分子在三维空间的折叠，通常认为构象表位将实现最有效的疫苗，因为它与天然的HCV表位相似。然而，培养HCV似乎有不可逾越的困难，只能得到极微量的病毒颗粒。而且，重组蛋白的表达和纯化也有大量问题，通常得到非正确折叠的蛋白。因此，多数HCV蛋白的体内结构还不清楚，也没有开展关于构象表位的确实的研究。再加之没有合适的体外培养系统和小动物模型，均严重阻碍了HCV感染的新的抗病毒药物的开发。黑猩猩是目前唯一可用来研究HCV感染、预防和治疗的动物模型，但这一模型只允许研究已选化合物。据报道(Deleersnyder等，1997)，E1包膜蛋白需要E2包膜蛋白以达到正确折叠状态。而且，有报道表明E1和E2形成异源二聚体，构成病毒包膜的基本单位(Yi等，1997)。但是，Houghton(1997)报道用重组gpE1E2(4×25μg)对3只慢性HCV感染的黑猩猩进行重复免疫，并未诱导出有意义的免疫应答。丙肝病人抗包膜免疫应答的诱导对病人来说是理想和有益的，因为此类抗体的高水平似乎与干扰素治疗的高反应性相关，因而有助于病人清除病毒(PCT/EP 95/03031，Maertens等)。慢性HCV携带者抗E1抗体的水平位于所有HCV抗体中最低者之列，因而对于提高这些抗体的水平，增强细胞反应以及诱导宿主对于感染的控制甚至清除等都可能是有益的。而且，高水平的抗E1细胞免疫似乎与干扰素治疗的高反应性相关(Leroux-Roels等，1996)。重要的是上述研究不依赖于天然样E1肽。NS3中HCV阳性血清检测的最关键表位与构象表位相关。显然，NS3表位散在分布于整个NS3蛋白(也参见Leroux-Roels等，1996；Rehermann等，1996，1997；Diepolder等，1995，1997)。在最初的分析中用的是NS3蛋白而非肽。分子生物学和基因工程的发展使得利用外源表达系统生产大量蛋白产物成为可能。然而，外源宿主的应用会导致重组产物生物和/或结构特性的不同。细胞合成过程中或合成后蛋白的生化修饰以及随后的纯化中，二硫键的形成和维持是非常重要的。半胱氨酸氧化还原状态与含二硫键蛋白的正确折叠或组装有着复杂的联系。而且，通常蛋白的生物功能是由其巯基基团的氧化状态调节或至少是受其影响的。对于一些酶的活性来说是如此，其中巯基基团氧化的可逆性和时间选择被称为生理控制机制(还参见Thomas等，1995；Nakamura等，1997；Aslund和Beckwith等，1999)。一些催化半胱氨酸氧化还原(巯基与二硫键形成)的蛋白因子已被识别(Mossner等，1998；Prinz等，1997；Loferer & Hennecke，1994)。这些蛋白因子大多属于“硫氧还蛋白超家族”，其成员的共有序列Cys-X-X-Cys(X＝任何氨基酸)中含有2个氧化还原活性半胱氨酸。该超家族依据活性位点的氧化还原电位，底物特异性或生物活性可分为不同类。另一分类法依据氧化还原活性中心的共有序列，即(i)通常以硫氧还蛋白(TRX)为代表的一类，由一些小的普遍存在的蛋白组成。其氧化还原活性中心的共有序列为Cys-X-pro-Cys，在许多物种都是高度保守的，从细菌到植物和哺乳动物(X＝任何氨基酸)。氧化状态的TRXOX在TRX-还原酶、FAD和NADPH存在时，可重新生成其还原形式。(ii)谷氧还蛋白(GRX)通常是硫氧还蛋白超家族第二类的代表。其氧化还原活性中心的共有序列为Cys-pro-X-Cys，其中X优选芳香族氨基酸，如Tyr和Phe。GRX和TRX均可作为有二硫键的还原剂，但GRX是特异的谷胱甘肽(GSH)-混合二硫还原酶，如在巯基化蛋白的还原中。已表明CXXC基序可能参与细胞内外的各种生化和生物功能。如巯基/二硫键转换反应、过渡金属的结合、脂质结合位点和调节活性如基因转录的控制、信号转导的调节(包括作为细胞因子发挥作用及类似情况)以及蛋白(解)巯基状态的控制。重要的是，CXXC基序可以在三级甚至四级蛋白结构发挥作用(也参见Thomas等，1995；Nakamura等，1997；Aslund和Beckwith等，1999)。HCV蛋白包含CXXC基序。然而，迄今为止，尚无报道表明或提示这些CXXC基序的可逆氧化还原状态对HCV具有重要性。而且，已有的纯化方法不能解决CXXC基序中可逆的二硫桥。这就导致了纯化的HCV蛋白的构象及生物学活性遭受损害。已有大量研究天然HCV蛋白的尝试。所遇到的问题是难以纯化出具有正确或天然样构象的HCV蛋白。因此，构象表位及其它依赖于天然样构象的生化和生物功能还是个谜。而且，治疗肝脏疾病和病毒性肝炎的药物靶也受到同样缺点的影响，药物筛选项目注定要失败。专利技术/目的概述表达和纯化系统的缺乏或低效性似乎影响了蛋白的正确折叠或组装，如此纯化出来的蛋白通常不具生物活性和/或正确的蛋白结构。这就导致天然抗HCV抗体无法对这些蛋白上的抗原决定簇的重要亚型进行识别，参见Houghton(1997)本专利技术克服了本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种ＨＣＶ蛋白或任何其功能相当部分，包含至少两个具有可逆氧化还原状态的半胱氨酸，半胱氨酸包含在氨基酸序列Ｃｙｓ－Ｘ↓［１］－Ｘ↓［２］－Ｃｙｓ中，其中氨基酸Ｘ↓［１］、Ｘ↓［２］均代表任何氨基酸。

【技术特征摘要】
...

【专利技术属性】
技术研发人员：A波斯曼，E德普拉，G梅尔滕斯，
申请(专利权)人：基因创新有限公司，
类型：发明
国别省市：BE[比利时]