一种水稻分泌型硫氧还蛋白基因及其应用制造技术

本发明专利技术公开了水稻的一种分泌型硫氧还蛋白基因及其编码蛋白以及应用，其目的是提供水稻的一种分泌型硫氧还蛋白基因及其编码蛋白以及利用此基因提高植物抗氧化活性及延缓植物衰老的方法。本发明专利技术所提供的水稻的一种分泌型硫氧还蛋白基因，其核苷酸序列是序列表中序列１中的ＤＮＡ序列；其所编码的氨基酸序列是序列表中序列２氨基酸残基序列。实验证明，将上述基因在水稻中过量表达，正常及盐胁迫下可以降低植株过氧化氢含量，提高叶绿素含量，从而延缓水稻衰老进程。本发明专利技术可在利用分子育种提高水稻抗氧化、抗衰老上有重要应用。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及水稻中一个编码分泌型硫氧还蛋白的基因，该基因通过调控水稻体内 氧化还原来调节水稻抗衰老，属于基因工程

技术介绍
细胞中的活性氧影响着许多生物学过程，如细胞增殖、分化、衰老及细胞程序性 死亡。在生物体中低水平的活性氧能够作为信号分子发挥作用，而高水平的活性氧会导致 生物大分子的氧化损伤。硫氧还蛋白通过可逆的二硫键和硫醇变化参与到氧化还原反应 中，进而影响细胞内的活性氧水平，调节细胞的生命活动。硫氧还蛋白最早是在大肠杆菌中 发现的，它能够还原核苷酸还原酶。动物体内只有一种类型的硫氧还蛋白(Trxl和Trx2)， 在小鼠基因敲除实验中发现Trxl或Trx2的缺失都会使小鼠在胚胎发育早期死亡。同动物 相比，植物体内有多种类型的硫氧还蛋白，并且其分布十分广泛，近年来越来越多的硫氧还 蛋白家族成员被发现，在拟南芥基因组中目前发现有42个基因编码硫氧还蛋白。在拟南芥 中，AtTrxhl及AtTrxh4的表达与细胞周期相关，暗示与细胞增殖时的氧化还原控制相关； 相反，AtTrxh5特异参与到防御及抗氧化胁迫反应中。在谷类植物中，Trxh遍布植物所有组 织中，但在种子中最为丰富，种子萌发时，TaTrxhA存在于糊粉和盾片细胞的核中，这种定位 与此组织的氧化环境有关。在大豆根瘤的发育过程中，一种GmTrxh扮演着重要的角色，其 能使酵母突变体恢复对过氧化氢的抗性，并且利用RNAi技术在大豆中将其干涉之后，转基 因大豆的根瘤则不能正常形成。目前，在水稻中关于h型硫氧还蛋白的功能研究还没有报 道。在正常情况下，植物细胞内活性氧的产生与清除处于动态平衡状态，活性氧浓度 较低，不会引起伤害。而植物在逆境(如干旱，热、冷、高盐等)胁迫条件下，体内会产生过 量的活性氧及过氧化物等分子，从而导致氧化损伤，引起植物衰老的发生，造成农作物的减 产。因此进一步搞清楚植物衰老的原因，延缓植物衰老进程，进而提高叶片的光合效率，对 于提高农作物的产量和质量具有重要的意义。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种水稻分泌型硫氧还蛋白基因，该基因通过抗氧化功能可 以降低正常及盐胁迫下水稻体内氧化还原水平，具有延缓水稻衰老的效果。实现本专利技术的目的采取的技术方案如下本专利技术利用本申请人前期在做双向电泳 时发现的一个水稻根质外体在盐胁条件下表达上调的蛋白，使用RT-PCR技术克隆出水稻 硫氧还蛋白基因OsTRXhl相应的编码序列。在工程菌中重组表达并纯化得到OsTRXhl蛋白， 还原胰岛素测试表明此纯化后的OsTRXhl蛋白具有氧化还原活性。将此OsTRXhl基因转入 硫氧还蛋白缺失的酵母突变体中发现此基因的表达能够使酵母突变体恢复对H202的抗性， 表明此基因参与了体内的氧化还原调控。将此基因在水稻中进行过量表达发现在正常生长 条件下及盐胁迫条件下能够降低过氧化氢含量，提高植物叶绿素含量，从而延缓转基因植3株的衰老；而用RNA干扰技术使此基因在水稻中表达下调，则会引起转基因植株过氧化氢 含量升高，叶绿素含量降低，植株提早衰老。本专利技术为通过基因工程手段进行分子育种提高 水稻抗衰老，进而提高农作物产量提供了可能。本专利技术取得的有益效果是本专利技术通过体外氧化还原测试和酵母互补测试表明 OsTRXhl是一个有氧化还原活性的硫氧还蛋白，亚细胞定位表明其为质外体蛋白。将此基因 在水稻中过量表达发现能够降低过氧化氢含量，延缓水稻衰老。在利用基因工程手段调控 植物体内氧化还原水平并在延缓水稻衰老，提高农作物产量上具有潜在利用价值。附图说明图1.纯化后的OsTRXhl-GST融合蛋白的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳图。其中，第 1泳道为蛋白Marker ；第2泳道为OsTRXhl-GST ；第3泳道为OsTRXhle43S_GST ；第4泳道为 GST。图2. OsTRXhl的体外氧化还原活性。其中空心正方形为5uM OsTRXhl-GST ； 实心正方形为2. 5uM OsTRXhl-GST ；空心圆为5uM 0sTRXhlc43S_GST ；实心圆为2. 5uM 0sTRXhlc43S-GST ；星号为 5uM GST。图3. OsTRXhl在硫氧还蛋白酵母突变体EMY63中具有抗过氧化氢活性试验。其中 1 为转 YcpIF5 空载体的 EMY63 ；2 为转 OsTRXhl 的 EMY63 ；3 为转 0sTRXhlG43S 的 EMY63 ；4 为 转 ScTRX 的 EMY63。图4. OsTRXhl的亚细胞定位研究证明其能够分泌到胞外。在洋葱及烟草叶片的表 皮细胞瞬时表达发现，OsTRXhl-YFP和OsTRXhl-GFP融合蛋白的荧光分布于细胞壁及细胞 膜(2和4)，这说明OsTRXhl能够分泌到质外体；而对照YFP和GFP的荧光主要分布于细胞 质及细胞核(1和3)。图中箭头所指为细胞壁。图5.在转录水平OsTRXhl (白色柱形图)在水稻中受盐和脱落酸诱导，但其同源 基因0sTRXh2(黑色柱形图)不受诱导。图6. OsTRXhl在水稻生长发育过程中的表达情况。转Pr0()sTKXhl :GUS的转基因水稻 的⑶S染色结果表明OsTRXhl在水稻生长发育过程中表达广泛。图7. OsTRXhl过表达株系在转录水平和蛋白水平的鉴定。实验结果表明OsTRXhl 在水稻中过表达成功。图8. OsTRXhl的RNA干涉株系在转录水平和蛋白水平的鉴定。实验结果表明 OsTRXhl在水稻中RNA干涉成功。图9. OsTRXhl的RNA干涉，过表达及野生型植株的表型比较。图10.水稻叶片的叶绿素含量测定。植株最上面的叶子为剑叶，依次向下分别 为第二，三，四，五叶。结果表明OsTRXhl的RNA干涉植株叶绿素含量明显低于野生型，而 OsTRXhl过表达植株叶绿素含量明显高于野生型。图中数据为三次重复的统计结果。图11.水稻叶片过氧化氢含量测定。结果表明过表达植株叶片过氧化氢含量低于 野生型，RNA干涉植株叶片过氧化氢含量高于野生型。图12.水稻根质外体活性氧含量检测。结果表明盐处理后过表达株系质外体活性 氧含量低于野生型，RNA干涉株系质外体活性氧含量高于野生型。具体实施例方式1.基因的获得此硫氧还蛋白是本申请人在做双向电泳时发现的水稻根质外体在盐胁条 件下表达上调的一个蛋白，蛋白Accession No.为gi | 3915131，其基因序列号为 AK121423。为了获得该基因，申请人提取了野生型水稻(Oryza sativa)的RNA，利用引物 5，-CCATGGCCGCCGAGGAGGGA-3，和 5，-CCATGGCGGCAGAAGCAGATGCAGCAGTG-3，进行 RT-PCR 扩 增，反应体系如下超纯水31ul，lOXPyrobest Buffer II 5ul，dNTP Mixture 4ul，上下游 引物各 4ul，Pyrobest DNA Polymerase 0. 2ul, cDNA 2ul。PCR 程序为94°C 5 分钟，94°C 30秒，61°C 30秒，72°C 50秒，第二到第四步循环27次，72°C 10分钟。PCR产物进行电泳， 胶回收，连接到T载体上，通过测序得到编码OsTrxhl的全长核苷酸序列(序列1)。2. 本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种水稻分泌型硫氧还蛋白基因，其特征是可以编码调控水稻体内氧化还原水平相关蛋白，该基因的核苷酸序列及相应的氨基酸序列如下：核苷酸序列：ａｔｇｇｃｃｇｃｃｇａｇｇａｇｇｇａｇｔｃｇｔｇａｔｃｇｃｃｔｇｃｃａｃａａｃａａｇｇａｃｇａｇｔｔｃｇａｃｇｃｃｃａｇａｔｇａｃｃａａｇｇｃｃａａｇｇａｇｇｃｃｇｇｃａａａｇｔｇｇｔｃａｔａａｔｔｇａｃｔｔｃａｃｔｇｃｔｔｃｃｔｇｇｔｇｔｇｇｃｃｃｔｔｇｃｃｇｃｔｔｃａｔｃｇｃｃｃｃａｇｔｇｔｔｃｇｃｔｇａａｔａｃｇｃｃａａａａａｇｔｔｃｃｃｔｇｇｔｇｃｔｇｔｃｔｔｃｃｔｇａａｇｇｔｔｇａｔｇｔｔｇａｔｇａｇｃｔｇａａｇｇａａｇｔｔｇｃｔｇａａａａｇｔａｃａａｔｇｔｃｇａｇｇｃａａｔｇｃｃｇａｃｃｔｔｃｃｔａｔｔｃａｔｃａａｇｇａｔｇｇｔｇｃｔｇａｇｇｃｔｇａｃａａｇｇｔｃｇｔｔｇｇｃｇｃｃａｇｇａａｇｇａｔｇａｃｃｔｃｃａｇａａｃａｃｃａｔｃｇｔｇａａｇｃａｃｇｔｃｇｇｔｇｃｃａｃｔｇｃｔｇｃａｔｃｔｇｃｔｔｃｔｇｃｃｔａａ氨基酸序列：ＭＡＡＥＥＧＶＶＩＡＣＨＮＫＤＥＦＤＡＱＭＴＫＡＫＥＡＧＫＶⅦＤＦＴＡＳＷＣＧＰＣＲＦＩＡＰＶＦＡＥＹＡＫＫＦＰＧＡＶＦＬＫＶＤＶＤＥＬＫＥＶＡＥＫＹＮＶＥＡＭＰＴＦＬＦＩＫＤＧＡＥＡＤＫＶＶＧＡＲＫＤＤＬＱＮＴＩＶＫＨＶＧＡＴＡＡＳＡＳＡ。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：郭毅，张翠军，
申请(专利权)人：河北师范大学，
类型：发明
国别省市：13[中国|河北]