用于诊断和治疗用途的纯化的丙型肝炎病毒外被蛋白制造技术

本发明专利技术涉及一种用于纯化选自Ｅ１和／或Ｅ２和／或Ｅ１／Ｅ２的ＨＣＶ单个的或特异性寡聚外被蛋白的方法，其特征在于，在为了分离所述重组表达的蛋白而裂解转化过的宿主细胞时，用一种二硫键裂解剂进行二硫键裂解或还原的步骤。本发明专利技术还涉及一种通过该方法所分离的组合物。本发明专利技术还涉及所述组合物的诊断和治疗用途。另外，本发明专利技术涉及将ＨＣＶ　　Ｅ１蛋白和肽用于预测和监测ＨＣＶ治疗的临床效果和／或临床结果的用途。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及重组蛋白表达、重组蛋白纯化、合成肽、HCV感染诊断、对HCV感染进行预性防治疗的一般领域，并且涉及患有慢性肝炎个体的治疗的临床效果的预测/监测治疗效果，或预测/监测天然疾病。更具体地讲，本专利技术涉及纯化丙型肝炎病毒外被蛋白的纯化方法，按照本专利技术所披露的方法所纯化的HCV外被蛋白在诊断、预防或治疗中的用途，以及单个的或特异性寡聚E1和/或E2和/或E1/E2外被蛋白在监测疾病、和/或诊断疾病、和/或治疗疾病的测定方法中的用途。本专利技术还涉及E1和/或E2外被蛋白表位，以及它的单克隆抗体及其在诊断、预防或治疗中的用途。
技术介绍
按照本专利技术所披露的方法，从细胞裂解物中纯化的E2蛋白能够与大约95％的患者的血清起反应。这种反应性类似于由CHO细胞中分泌的E2所获得的反应性(Spaete等，1992)。不过，细胞内表达形式的E2可能更接近于天然病毒外被蛋白，因为它含有高含量的甘露糖碳水化合物基序，而由CHO细胞中分泌的E2蛋白，由半乳糖和唾液酸糖成分进行过进一步的修饰。当E2的氨基末端部分是在杆状病毒系统中表达时，只能在来自若干患者组的大约13-21％的血清中检测到(Inoue等。1992)。在用大肠杆菌表达E2之后，HCV血清的反应性甚至更低，在14(Yokosuka等，1992)-17％(Mita等，1992)范围内。使用本专利技术的纯化的、疫苗表达的重组E1蛋白，大约有75％的HCV血清(以及95％的慢性患者)是抗E1阳性的，与Kohara等(1992)和Hsu等(1993)的结果形成了鲜明的对比。Kohara等使用痘苗病毒表达的E1蛋白，并且在7-23％的患者体内检测到抗E1抗体，而Hsu等使用杆状病毒表达的E1检测了14/50(28％)的血清。以上结果表明，为了获得所述外被蛋白与人类患者血清的高的反应性，不仅需要好的表达系统，而且还需要好的纯化方法。这一目的可以通过使用本专利技术的正确的表达系统和/或纯化方法而实现，该方法能确保保持所述蛋白的天然折叠，并且本专利技术的纯化方法可以确保消除污染性蛋白，它能保持HCV外被蛋白的构象，并因此保持其反应性。诊断性筛选测定所需要的纯化HCV外被蛋白的量为每年数克。对于疫苗用途来说，可能需要更大量的外被蛋白。因此，可以利用所述痘苗病毒系统筛选最佳的表达构建体，并且用于有限的扩大表达，并且，在用若干酵母菌株表达时，可以实现大规模表达和纯化含有高甘露糖碳水化合物的单个的或特异性的寡聚外被蛋白。例如，对于乙型肝炎来说，与酵母产生的乙型肝炎疫苗相比，用哺乳动物细胞生产H BsAg的成本更高。本专利技术的目的本专利技术的一个目的是提供一种纯化重组表达的E1和/或E2和/或E1/E2蛋白的新方法，以便能够以不含杂质的单个的或特异性寡聚重组蛋白形式而不是凝聚体的形式，将所述重组蛋白直接用于诊断和疫苗接种目的。本专利技术的另一个目的是提供含有纯化的(单个的或特异性寡聚的)重组E1和/或E2和/或E1/E2糖蛋白的组合物，所述糖蛋白含有来自HCV的E1和/或E2和/或E1/E2结构域的构象表位。本专利技术的另一个目的是提供用于重组表达E1和/或E2和/或E1/E2蛋白的新的重组载体构建体，以及用所述载体构建体转化过的宿主细胞。本专利技术的另一个目的是提供一种用于生产并纯化重组HCV E1和/或E2和/或E1/E2蛋白的方法。本专利技术的另一个目的是提供本专利技术的重组HCV E1和/或E2和/或E1/E2蛋白的诊断和免疫原用途，以及提供将含有本专利技术的任意一种重组HCV E1和/或E2和/或E1/E2蛋白的用于诊断目的的试剂盒、疫苗或治疗剂。本专利技术的另一个目的是提供将E1和/或E2和/或E1/E2蛋白或其适当的部分用于监测/预测对患有HCV感染的患者进行治疗(例如，用干扰素治疗)的反应的新的用途。本专利技术的另一个目的是提供将本专利技术的重组E1和/或E2和/或E1/E2蛋白用于HCV筛选和证实抗体测定的用途。本专利技术的另一个目的是提供可用于诊断HCV感染并用于制备抗体的E1和/或E2肽。所述肽还可用于分离人单克隆抗体。本专利技术的另一个目的是提供单克隆抗体，尤其是人单克隆抗体或人源化的小鼠单克隆抗体，这种抗体能与肽或重组蛋白中的构象表位所包含的E1和/或E2表位特异性地起反应。本专利技术的另一个目的是提供将抗E1或抗E2单克隆抗体用于HCV抗原检测或用于慢性HCV感染治疗的可能的用途。本专利技术的再一个目的是提供用于监测/预测对患有HCV感染的患者进行治疗(例如，用干扰素治疗)的反应或监测/预测所述疾病的后果的试剂盒。本专利技术的所有目的都可以通过下面所提供的实施方案而实现。定义下面的定义用于解释在本专利技术中所使用的不同的术语和表达形式。术语‘丙型肝炎病毒单个外被蛋白’表示含有一种氨基酸序列(和/或氨基酸类似物)的多肽或其类似物(例如，模拟表位)，该序列确定了E1或E2区的至少一个HCV表位。所述单个外被蛋白在其广义的含义上可以是单体或同型寡聚物形式的、重组表达的外被蛋白。通常，限定所述表位的序列相当于HCV的E1或E2区的氨基酸序列(相同或者通过用天然氨基酸残基类似物取代而不会破坏该表位)。一般，表位限定序列的长度为3个或3个以上氨基酸，更优选5个或5个以上氨基酸，更优选8个或8个以上氨基酸，更优选10个或10个以上氨基酸。对于构象表位来说，所述表位限定序列的长度可以有较大的改变，因为确信这种表位是由抗原的三维形状形成的(例如，折叠)。因此，限定所述表位的氨基酸的数量可以比较少，而且广泛分布在该分子的长度上，通过折叠形成正确的表位构象。位于限定表位的残基之间的抗原部分，对于该表位的构象的结构来说可能并不重要。例如，只要保留了对表位构象重要的序列(例如，与二硫键结合有关的半胱氨酸，糖基化位点等)，缺失或取代这些间插序列可能不会影响该构象表位。构象表位还可以通过同型寡聚物或异源寡聚物的亚基的两个或两个以上关键区而形成。本专利技术的HCV抗原包括来自HCV的E1和/或E2(外被蛋白)结构域的构象表位，被认为对应于病毒外被蛋白的E1结构域，目前估计跨越HCV多蛋白的192-383号氨基酸(Hijikada等，1991)。在哺乳动物系统中进行表达(糖基化的)时，通过SDS-PAGE测定相信具有大约35kDa的分子量。据信以前被称为NS1的E2蛋白跨越HCV多蛋白的384-809或384-746号氨基酸(Grakoui等，1993)，并且它也是一种外被蛋白，在疫苗系统中表达时(糖基化的)据信它具有大约72kDa的表观凝胶分子量。相信这些蛋白的终点是大致的(例如，E2的羧基末端可能位于730-820号氨基酸片段中的某一位置上，例如，以730、735、740、742、744、745号氨基酸为终点，优选以746、747、748、750、760、770、780、790、800、809、810、820号氨基酸为终点)。所述E2蛋白还可以与E1、P7(747-809号氨基酸)、NS2(810-1026号氨基酸)、NS4A(1658-1711号氨基酸)或NS4B(1712-1972号氨基酸)一起表达。与上述其他HCV蛋白一起表达，对于获得正确的蛋白折叠来说是重要的。还应当理解的是，在本专利技术的实施例部分所使用的分离物不是要用来限定本专利技术范围的，并且来本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种治疗用疫苗组合物，含有治疗有效量的：含有选自Ｅ１蛋白和Ｅ２蛋白的至少一种纯化的重组ＨＣＶ单个的或特异性寡聚的重组外被蛋白；并选择性地含有可以药用的佐剂的组合物。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：G梅尔藤斯，F波斯曼，E德普，
申请(专利权)人：基因创新有限公司，
类型：发明
国别省市：BE[比利时]