HCV包膜蛋白颗粒:用于疫苗接种的用途制造技术

本发明专利技术涉及ＨＣＶ包膜蛋白颗粒用于疫苗接种的用途。本发明专利技术基于这样的发现：ＨＣＶ包膜蛋白在慢性ＨＣＶ感染的黑猩猩诱导有益的免疫应答。优选采用以去垢剂辅助的方式生产的颗粒型ＨＣＶ包膜蛋白进行疫苗接种。当将这样的包膜蛋白给予慢性ＨＣＶ携带者时，所述包膜蛋白具有高度免疫原性，并既刺激细胞免疫应答，又刺激体液免疫应答。（*该技术在2019年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
HCV包膜蛋白颗粒用于疫苗接种的用途本申请是申请日为1999年6月23日，申请号为99809890.6，发 明名称为"HCV包膜蛋白颗粒用于疫苗接种的用途"的专利技术专利申 请的分案申请。专利
本专利技术是基于这样的发现HCV包膜蛋白在处于异种亚型la或 亚型lb HCV林慢性感染的黑猩猩中诱导有益的免疫应答。更具体地 说，本专利技术涉及这样的发现包膜蛋白的免疫原性高并导致既刺激细 胞免疫应答，也刺激体液免疫应答。而且，本专利技术还涉及这样的发现 通过烷化作用封闭半胱氨酸产生免疫原性甚至更高的蛋白。此外，本 专利技术的包膜蛋白可以加入到具有高免疫原性和免疫反应性的颗粒中。 进一步证实这样的颗粒可以加入其它蛋白。专利技术背景丙型肝炎病毒(HCV)感染是发达国家和发展中国家存在的主要健 康问题。据估计，约有l-5。/o的世界人口受到丙型肝炎病毒的影响。HCV 感染似乎是输注性肝炎最重要的原因，并常常发展为慢性肝损害。而 且有证据表明，HCV诱发肝细胞癌。所以，迫切需要可靠的诊断方法 和有效的治疗药物。也需要对HCV污染的血液制品敏感和特异性的筛 选方法以及对HCV培养的改良方法。HCV是约有9,600个碱基的正链RNA病毒，它编码至少三种结 构蛋白和6种非结构蛋白。根据序列同源性，结构蛋白在功能上分为 唯一的核心蛋白和两种包膜蛋白El和E2。 El由192个氨基酸组成， 并根据HCV基因型包含5-6个N-糖基化位点。E2蛋白由363-370 个氨基酸组成，并根据HCV基因型包含9-11个N-糖基化位点(关于其 综述见Major和feinstone， 1997; Maertens和Stuyver, 1997)。 El蛋白 含有各种可变域(Maertens和Stuyver, 1997)，而E2蛋白含有3个高 变域，其中主域位于所述蛋白的N末端(Maertens和Stuyver, 1997)。后一种包膜蛋白已通过重组技术在大肠杆菌、昆虫细胞、酵母细胞和 哺乳动物细胞产生。表达系统在高级真核生物、尤其是哺乳动物细胞 培养物中的应用产生被患者样品中的抗体有效识别的包膜蛋白(Maertens等，1994)。已经提出El包膜蛋白需要E2包膜蛋白才能达到合适的折叠状态 (Deleersnyder等，1997)。另夕卜，已经提出El和E2可形成构成病毒 包膜基本单位的异二聚体(Yi等，1997)。在Liang等的WO 98/21338 中，已将这些设想用于构建HCV颗粒，该颗粒由El和E2以及核心 蛋白和P7组成。换句话说，现有技术没有指出分别将El或E2用于 免疫接种和其它目的。但是Houghton (1997)报告，采用重组gpElE2(4 x 25吗)反复接种免疫3只慢性HCV感染黑猩猩并没有诱发显著的免 疫应答。本申请的专利技术人推论，在慢性丙型肝炎患者诱导抗包膜免疫 应答应该切实可行，并有益于所述患者，因为似乎较高水平的这样的 抗体与对干扰素治疗的良好反应有关，从而有助于所述患者清除所述病毒(Matertens等的PCT/EP 95/03031)。本专利技术的专利技术人进一步推论， 因为在慢性HCV携带者中抗El抗体水平是所有HCV抗体中最低的， 所以升高这些抗体的水平可能是有益的，而且所述细胞应答可诱导控 制甚或消除所述宿主的感染。对E1的高水平细胞免疫似乎也与对千扰 素治疗的良好反应有关(Leroux-Roels等，1996)。除了抗E1免疫与干扰素治疗有关的重要性外，其它种种迹象表 明，HCV基因组的某些其它部分可能对诱导可允许控制感染的特异 性免疫应答是重要的。在干扰素治疗反应患者中还更为常见地观察到 对所述核心蛋白C末端区的T细胞反应性(Leroux-Roels等，1996)。 在肝移植后消除了 HCV的患者中证实了抗NS4B蛋白的潜在中和抗体 (Villa等，1998)。也已对NS3中的几种T细胞表位作图，这几种表位 似乎与急性期清除HCV有关(参见Leroux-Roels等的PCT/EP 94/03555; Leroux-Roels等，1996; Rehermann等，1996和1997; Diepolder等，1995和1997)。此外，抗NS5A的抗体如El抗体在oc 干扰素治疗之前为基线水平的长时性反应者(LTR)中具有较高水平，这是与无反应者比较而言。目前HCV的治疗性疫苗接种还未取得成功。而且预防性疫苗接 种仅显示对HCV同种病毒抹的有效预防(Choo等，1994)。本专利技术涉 及令人惊奇的发现，即给予HCV包膜抗原能够显著改善异种病毒株或 分离抹感染的个体的慢性活动性肝炎的病况，对于异种亚型la或异种 亚型lb感染都可以。实际上，给予6个剂量的50 (ig Els(即El的 192-326氨基酸)的慢性感染的黑猩猩令人惊奇地显示强烈的体液免疫 和细胞免疫应答,所述免疫应答在后一疫苗接种之前的整个慢性感染 期间均未成功建立。而且在免疫接种后2-5个月内在肝脏检测不到病 毒抗原并在免疫接种后至少5个月仍然不能检测到病毒抗原。尽管血 清的HCV-RNA滴度并未下降，但是血清肝脏酶水平显示明显正常化 趋势。最重要的是，两只受疫苗接种的黑猩猩的肝脏组织学均显著改 善。本专利技术还涉及的令人惊奇的发现是，用于疫苗接种的El蛋白表达 为不需要疏水性锚的单一 HCV蛋白，它可形成稳定的颗粒。还应该注 意的是，为了避免诱导针对非相关表位的免疫应答，构建为从一个慢 性携带者的单 一 血清样品获得的各个克隆的共有序列的用于免疫接种 的E1蛋白。本申请另外涉及的发现是，通过采用基'因型不同于所述宿 主感染的基因型的抗原可增强诱导所述抗E1应答。而且，本申请涉及 以下发现例如借助于N-(碘乙基)-三氟乙酰胺、乙烯亚胺或活性卤素 如碘乙酰胺烷基化HCV包膜蛋白的半胱氨酸时，上述寡聚颗粒显示甚 至更高的免疫原性。最后，本专利技术还涉及以下发现在上述的寡聚颗 粒中HCV包膜蛋白的半胱氨酸突变为任何其它天然存在的氨基酸,优 选突变为蛋氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺或赖氨酸，这样的突变与原包膜 蛋白相比也产生更高的免疫原性。专利技术目的由文献可知，迫切需要开发可靠的HCV疫苗和有效的HCV治疗药物。所以，本专利技术的目的是提供能够甚至在(不仅限于此)慢性HCV携带者中诱导针对HCV包膜蛋白的特异性体液免疫和细胞免疫的抗 原制剂。所述相同抗原能用于所述免疫应答的诊断。更具体地说，本专利技术的目的是提供以上定义的抗原制剂，它含有单一HCV包膜蛋白的稳定颗粒。应该清楚的是，这样的颗粒或制备这 样的颗粒的方法是本领域未知的。而且，本领域没有证据指出，包括 这样的稳定颗粒或所述纯化的单一 HCV包膜蛋白的任何抗原制剂可 成功用作针对HCV的(异种)预防性或治疗性疫苗。因此，本专利技术的目 的是，除了提供编码HCV抗原的DNA疫苗外，还提供能够成功用作 针对HCV的预防性剂或治疗剂的稳定颗粒的生产方法。更具体地说， 本专利技术的目的是，提供基于去垢剂辅助颗粒形成的该稳定颗粒的生产 方法(参见下文)。此外，本专利技术的目的是提供从不同HCV基因型获得 抗原组成的颗粒的制备方法。此外，本专利技术的目的是提供为各个克隆的共有序列的抗原，所述 共有序列使得所述蛋白更正确地折叠。这是为了避免刺激针对非相关 本文档来自技高网...

【技术保护点】
主要包括ＨＣＶ包膜蛋白而且其直径为１－１００ｎｍ的寡聚颗粒。

【技术特征摘要】
...

【专利技术属性】
技术研发人员：E德普拉，G梅尔滕斯，A波斯曼，F范韦宁戴勒，
申请(专利权)人：基因创新有限公司，
类型：发明
国别省市：BE[比利时]