一种荧光探针及其在可逆检测过氧化亚硝酰中的应用制造技术

一种荧光探针及其在可逆检测过氧化亚硝酰中的应用涉及一类在ONOO-存在下荧光发生增强，在还原性物质存在下荧光又恢复原来状态的荧光探针。本发明专利技术提供了一种可用于选择性检测细胞内ONOO-的可逆荧光探针。本发明专利技术采用花菁染料作为荧光母体，在花菁母体上引入有机硒醚结构作为与ONOO-反应的活性中心，以实现选择性地检测ONOO-；利用有机硒醚被氧化后形成的有机硒氧化物容易被生物体系中的还原性小分子如半胱氨酸、还原型谷胱甘肽、金属硫蛋白等还原为有机硒醚的性质，实现探针分子的可逆性；并同时利用有机硒醚氧化前后电子性质的变化及其对整个化合物荧光性质的影响调变探针分子的荧光性质。

【技术实现步骤摘要】

：本专利技术涉及一类用于可逆检测过氧化亚硝酰(ONOO-)的荧光探针，具体的说，是一类在ONOO-存在下荧光发生增强，在还原性物质如半胱氨酸、还原型谷胱甘肽、金属硫蛋白等存在下荧光又恢复原来状态的荧光探针。
技术介绍
：过氧化亚硝酰(ONOO-)是一种具有强氧化性的短寿命活性物种，在人体内由一氧化氮和超氧负离子反应产生。ONOO-能作用于被免疫系统识别的病菌等有害物质而使之失活，从而保护机体免受有害物质侵害，维持细胞和组织的正常功能。但是，在细菌感染等病理条件下，大量ONOO-的产生会导致缺血再灌注损伤、风湿性关节炎、败血症、中风、多发性硬化、动脉硬化、肠炎、癌症及多种神经退行性疾病。然而，长久以来，检测手段的缺乏阻碍了人们对ONOO-在生命体系中作用行为的研究。荧光探针是有效检测生命体内ONOO-的手段之一。一个具有应用前景的荧光探针应具有作用前后荧光变化明显、对目标分子响应快、选择性好、可用于实时可逆检测等优点。Tetsuo Nagano等公开了一类用以检测高反应性活性氧的荧光探针HPF及APF(结构见图1，T.Nagano et.al，J.Bio.Chem，2003，278，3170)，与ONOO-作用后荧光增强从而检测ONOO-的存在。但是这类荧光探针同时对羟自由基、次氯酸根等活性物种响应灵敏，不能用于专一性地检测ONOO-，也不具有可逆性，不能用于ONOO-的实时检测。Dan Yang等公开了一种检测ONOO-的荧光探针HKGreen-1(结构见图1，Dan Yang et.al，J.Am.Chem.Soc，2006，128，6004)，次氯酸根不干扰ONOO-的检测，但羟自由基对ONOO-检测的干扰很大，并且这种探针不具有可逆性，不能用于ONOO-的实时检测。最近，Dan Yang等公开了一种检测ONOO-的荧光探针HKGreen-2(结构见图1，Dan Yang et.al，Org.Lett.，2009，11，1887)，该探针仍然对羟自由基有较强响应，并且不具有可逆性，不能用于ONOO-的实时检测。由于不具有可逆性，上述探针无法准确提供生物体系中由ONOO-引起的氧化应激随时间变化的情况，不具有应用前景。开发具有选择性，可用于生物体系中ONOO-实时可逆检测的荧光探针具有重要意义。
技术实现思路
：本专利技术就是针对上述问题，提供了一种可用于选择性检测细胞内ONOO-的可逆荧光探针，此探针可以选择性地与ONOO-作用，作用后荧光强度发生改变，在还原性物质如半胱氨酸、还原型谷胱甘肽、金属硫蛋白等存在下荧光又可以恢复到原先状态。为了实现本专利技术的上述目的，本专利技术采用如下技术方案：本专利技术采用花菁染料作为荧光母体，在花菁母体上引入有机硒醚结构作为与ONOO-反应的活性中心，以实现选择性地检测ONOO-；利用有机硒醚被氧化后形成的有机硒氧化物容易被生物体系中的还原性小分子如半胱氨酸、还原型谷胱甘肽、金属硫蛋白等还原为有机硒醚的性质，实现探针分子的可逆性；并同时利用有机硒醚氧化前后电子性质的变化及其对整个化合物荧光性质的影响调变探针分子的荧光性质。所述的荧光探针的通式为：通式Ⅰ：R1-Se-R2-Y-R7，通式Ⅰ中，R1为C1-20的烷基，R2为C1-15的烷基；Y为R′-C-R″，NR’，O，S，或Se，其中R’，R”为H或C1～C10的烷基；R’、R”相同或不同；R7为染料母体，染料母体为一甲川花菁、三甲川花菁、五甲川花菁或七甲川花菁。当R7为七甲川花菁时，所述荧光探针的通式为：通式ⅢR3为C1～C20的烷基，最佳为C1～C10的烷基；R4为C1～C20的烷基，最佳为C1～C10的烷基；R5、R6为H、C1～C20的烷基、磺酸基、羧基、羟基、卤素、氨基、胺基、烷氧基、氰基或硝基；R5、R6相同或不同；R5或R6为环烷基时，与各自相连的苯环以单键的方式连接或以并环的方式连接。将通式Ⅰ应用于检测ONOO-时，其是与ONOO-作用后，生成具有通式Ⅱ结构的化合物，从而导致荧光的改变；通式Ⅱ；具有通式Ⅱ结构的化合物，在还原性物质存在下，重新变为具有通式Ⅰ结构的化合物，从而导致荧光的恢复。所述还原性物质为半胱氨酸、还原型谷胱甘肽或金属硫蛋白。将通式Ⅲ应用于检测ONOO-时，其是与ONOO-作用后，生成具有通式Ⅳ结构的化合物，从而导致荧光的改变；通式Ⅳ具有通式Ⅳ结构的化合物，在还原性物质存在下，重新变为具有通式Ⅲ结构的化合物，从而导致荧光的恢复。通式Ⅰ可对ONOO-进行定性、定量的检测。将浓度呈梯度变化的过氧化亚硝酰水溶液分别加入通式Ⅰ的水溶液中，分别测定加入后各体系的荧光强度，然后以过氧化亚硝酰溶液的浓度和加入后体系的荧光强度为横坐标、纵坐标作图，根据荧光强度，即可从图中读出溶液中过氧化亚硝酰的含量。用通式Ⅰ测定生物体系中的ONOO-，其荧光强度随生物体系的氧化还原电位而改变，能够对生物体系中的ONOO-的进行实时可逆检测。通式Ⅲ所代表的化合物，本身荧光很弱，可以特异性地与ONOO-迅速作用，生成通式Ⅳ所代表的的硒氧化物，同时荧光增强；通式Ⅳ所代表的具有较强荧光的硒氧化物与还原性物质如半胱氨酸、还原型谷胱甘肽、金属硫蛋白等作用会重新回到具有通式Ⅲ所代表的结构的化合物，相应的荧光也变回初始的较弱的状态。具有通式Ⅲ结构的化合物用作ONOO-荧光探针测定生物体系中的ONOO-，其荧光强度随生物体系的氧化还原电位而改变，能够对生物体系中的ONOO-的进行实时可逆检测；具体的说就是，当生物体系中ONOO-的浓度增加时，其与探针作用而生成的具有通式Ⅳ结构的化合物的浓度增加，从而导致荧光增强；在此基础上，当生物体系中还原性物质增加时，ONOO-的浓度降低，先前被ONOO-氧化而生成的具有通式Ⅳ结构的化合物也会被还原到具有通式Ⅲ结构的化合物，从而导致荧光减弱。所述荧光探针与ONOO-作用后荧光增强是由于生成了具有通式Ⅳ结构的化合物。也就是说，荧光探针与被检测物种作用后荧光发生增强并不是荧光探针本身的荧光发生了增强，而是其氧化产物使检测体系的荧光增强了。硒原子是本专利技术所述荧光探针的反应中心。即硒原子提供具有通式Ⅲ结构的化合物与ONOO-选择性作用的活性中心，也提供具有通式Ⅳ结构的化合物与还原性物质如半胱氨酸作用的活性中心。同时，本专利技术所述荧光探针的荧光变化也是由有机硒片段的氧化还原状态调节。具有通式Ⅲ结构的本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．一种荧光探针，其特征在于，所述的荧光探针的通式为：通式Ⅰ：Ｒ１－Ｓｅ－Ｒ２－Ｙ－Ｒ７，通式Ⅰ中，Ｒ１为Ｃ１－２０的烷基，Ｒ２为Ｃ１－１５的烷基；Ｙ为Ｒ′－Ｃ－Ｒ″，ＮＲ’，Ｏ，Ｓ，或Ｓｅ，其中Ｒ’，Ｒ”为Ｈ或Ｃ１～Ｃ１０的烷基；Ｒ’、Ｒ”相同或不同；Ｒ７为染料母体，染料母体为一甲川花菁、三甲川花菁、五甲川花菁或七甲川花菁。

【技术特征摘要】
1.一种荧光探针，其特征在于，所述的荧光探针的通式为：
通式Ⅰ：R1-Se-R2-Y-R7，
通式Ⅰ中，R1为C1-20的烷基，R2为C1-15的烷基；
Y为R′-C-R″，NR’，O，S，或Se，其中R’，R”为H或C1～C10的烷
基；R’、R”相同或不同；
R7为染料母体，染料母体为一甲川花菁、三甲川花菁、五甲川花菁或七甲
川花菁。
2.根据权利要求1所述的荧光探针，其特征在于，R7为七甲川花菁，所
述荧光探针的通式为：
通式Ⅲ
R3为C1～C20的烷基，最佳为C1～C10的烷基；
R4为C1～C20的烷基，最佳为C1～C10的烷基；
R5、R6为H、C1～C20的烷基、磺酸基、羧基、羟基、卤素、氨基、胺基、烷
氧基、氰基或硝基；R5、R6相同或不同。
3.根据权利要求2所述的荧光探针，其特征在于，R3最佳为C1～C10的烷
基，R4最佳为C1～C10的烷基。
4.根据权利要求2所述的荧光探针，其特征在于，R5或R6为环烷基，与各
自相连的苯环以单键的方式连接或以并环的方式连接。
5.一种权利要求1所述的荧光探针在实时可逆检测过氧化亚硝酰中的应用，
其特征在于，将通式Ⅰ应用于检测...

【专利技术属性】
技术研发人员：韩克利，李鹏，于法标，孙小飞，
申请(专利权)人：中国科学院大连化学物理研究所，
类型：发明
国别省市：91