【技术实现步骤摘要】
本申请属于真菌毒素检测领域，具体涉及含有tr512多肽的融合蛋白功能化修饰的纸基用于ota的快速检测方法。
技术介绍
1、赭曲霉毒素a(ota)是真菌毒素的典型代表，它一般由曲霉、镰刀菌和青霉菌等分泌。ota广泛存在于各种食品中，如坚果、谷物、油、咖啡和葡萄酒等。它被认为是最潜在的致癌物之一(2b组)，对人类和动物具有肾毒性、肝毒性、免疫毒性和胚胎毒性。因此，许多国家已经对食品中的ota水平设定了限制。
2、近年来，人们开发了许多快速、灵敏的ota检测平台，以确保食品安全，避免ota污染风险。众所周知，传统的色谱方法，如高效液相色谱(hplc)，气相色谱(gc)和质谱(ms)分析是ota分析常用的分析技术。然而，色谱方法检测耗时，设备复杂，样品预处理繁琐，极大地阻碍了其在真实样品中的实际应用。除此之外，酶联免疫吸附试验(elisa)也经常用于ota筛查；虽然其具有很高的灵敏度，但免疫分析存在交叉反应、基质干扰和抗体不稳定等问题。因此，在实际应用中，仍然迫切需要一种简单、经济、灵敏的ota检测方法。
技术实现思路
1、基于以上内容，本申请开发了一种基于功能化修饰纸基的高灵敏真菌毒素快速检测方法与装置。本申请实验选取赭曲霉毒素a(ota)进行检测，gst-tr512-6×his蛋白功能化的纸基使其能够捕获经三螺旋开关与ota结合后产生的(ota-afdna)复合物。本申请检测方式极大的提高了检测的灵敏度，检测成本低廉，并且操作方式简单。
2、为了提供一种高灵敏的
3、本申请提供了一种基于功能化修饰纸基的ota检测方法，包括以下步骤：
4、一种基于功能化修饰纸基的赭曲霉毒素a检测方法，包括以下步骤：
5、步骤1)通过三螺旋适配体开关结构转换，获得(ota-afdna)复合物；其中三螺旋适配体开关包含：afdna和qdna，其中afdna上标记德克萨斯红荧光团；qdna上标记淬灭基团bhq2；
6、步骤2)采用功能化修饰的纸基捕获并富集(ota-afdna)复合物；所述功能化修饰的纸基上固载有含有tr512多肽的融合蛋白；
7、步骤3)对捕获并富集(ota-afdna)复合物的功能化修饰的纸基进行信号检测。
8、可选地，所述含有tr512多肽的融合蛋白通过溶胶凝胶体固载于纸基上；所述含有tr512多肽的融合蛋白与溶胶凝胶体以静电作用相互结合；所述溶胶凝胶体水解后带有正电荷。
9、可选地，所述含有tr512多肽的融合蛋白的固载量为1×10-10mol～5×10-10mol；
10、可选地，所述溶胶凝胶体为3-氨丙基三乙氧基硅烷溶胶凝胶体。
11、可选地，根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述tr512的氨基酸序列为ggg skvilfe gpag rwtwpeise gapg skvilfe ggpg。
12、可选地，所述含有tr512多肽的融合蛋白为gst-tr512-6×his融合蛋白。
13、可选地，所述功能化修饰的纸基的制备方法包括：将含有溶胶凝胶体的溶液i滴加于纸基的检测区，干燥后将含有融合蛋白的溶液ii添加于纸基的检测区，干燥，得所述功能化修饰的纸基。
14、可选地，所述溶液i与溶液ii的体积比为1:100～1:500；所述溶液中，溶胶凝胶体的浓度为0.61mm～5mm；所述溶液中，融合蛋白的浓度为1μm～20μm。
15、可选地，所述afdna由中心的环状ota适配体序列和两个臂状片段组成，臂状片段在3’端标记德克萨斯红荧光团；qdna与afdna茎端序列互补，并在5’端标记淬灭基团bhq2。
16、可选地，所述的afdna与qdna的体积比为1：2；
17、所述的afdna与qdna的浓度比为1：1；
18、可选地，所述的afdna的茎长为7个碱基；
19、可选地，所述的afdna与qdna形成三螺旋开关的条件是8-12分钟，30-37℃
20、可选地，所述的afdna与qdna形成三螺旋开关的条件是10分钟，37℃。
21、可选地，所述的三螺旋开关检测ota的条件是时间为45-55分钟，温度为30-37℃
22、可选地，所述的三螺旋开关检测ota的条件是时间为50分钟，温度为37℃；
23、可选地，所述的三螺旋开关检测ota的结合缓冲液的ph是6.0-6.5
24、可选地，所述的三螺旋开关检测ota的结合缓冲液的ph是6.5。
25、可选地，步骤(3)中，采用手持荧光检测仪进行信号检测；
26、可选地，所述手持荧光检测仪包括led激发光、570nm的滤光片、610nm的滤光片、ccd相机。
27、本申请中，gst-tr512-6×his蛋白与aptes溶胶凝胶以静电作用结合，将gst-tr512-6×his蛋白固载于纸基上，其中tr512多肽作为主要的功能基团，能与texas red标记的核酸发生非共价、高亲和力的结合；谷胱甘肽s-转移酶(gst,pdb id:im99)是一种高可溶性蛋白，广泛应用于多种融合蛋白的表达；蛋白尾端的6×his主要用于蛋白纯化的目的。
28、作为本申请的一种实施方式，提供一套基于功能化修饰纸基的高灵敏ota快速检测的方法，所述方法采用三螺旋适配体开关与ota混合，随后采用上述方法制备得到的gst-tr512-6×his融合蛋白功能化修饰的纸基捕获并富集(ota-afdna)复合物，最后以手持的荧光检测仪器进行信号检测。
29、可选地，所述方法包括：
30、s1：采用三螺旋适配体开关与ota混合，本申请的三螺旋适配体开关保持了ota适配体的高特异性与高亲和性
31、s2：采用gst-tr512-6×his融合蛋白功能化修饰的纸基捕获并富集(ota-afdna)复合物，本申请蛋白功能化修饰的纸基制备简单，成本低廉
32、s3：采用手持的荧光检测仪器进行信号检测手持荧光检测仪器成本低廉，重要部件由激发光，两个滤光片，以及一个相机组成，后续数据处理由adobe photoshop采用rgb中的红色通道数值r值完成
33、s4：ota检测信号的产生包含但不限于：三螺旋适配体开关
34、s5：三螺旋适配体开关与ota混合后的混合溶液滴加于制备的gst-tr512-6×his融合蛋白功能化的纸基上，随后在手持荧光检测仪器上可以明显看出随着ota检测浓度的增大，功能化纸基上的荧光强度值在明显增强。
35、具体地，所述应用包括：(1)纸基的设计及制备：图案由adobe photoshop本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种基于功能化修饰纸基的赭曲霉毒素A检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述含有TR512多肽的融合蛋白通过溶胶凝胶体固载于纸基上；所述含有TR512多肽的融合蛋白与溶胶凝胶体以静电作用相互结合；所述溶胶凝胶体水解后带有正电荷。
3.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，所述含有TR512多肽的融合蛋白的固载量为1×10-10mol～5×10-10mol；
4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述TR512的氨基酸序列为GGGSKVILFE GPAG RWTWPEISE GAPG SKVILFE GGPG；
5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述功能化修饰的纸基的制备方法包括：将含有溶胶凝胶体的溶液I滴加于纸基的检测区，干燥后将含有融合蛋白的溶液II添加于纸基的检测区，干燥，得所述功能化修饰的纸基。
6.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，所述溶液与溶液的体积比为1:100～1:500；所述溶液I中，溶胶凝胶体的浓度为0.61mM～5mM
7.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述AFDNA由中心的环状OTA适配体序列和两个臂状片段组成，臂状片段在3’端标记德克萨斯红荧光团；QDNA与AFDNA茎端序列互补，并在5’端标记淬灭基团BHQ2；
8.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于，
9.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于，所述的三螺旋开关检测OTA的条件是时间为45-55分钟，温度为30-37℃；
10.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤3)中，采用手持荧光检测仪进行信号检测；
...【技术特征摘要】
1.一种基于功能化修饰纸基的赭曲霉毒素a检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述含有tr512多肽的融合蛋白通过溶胶凝胶体固载于纸基上；所述含有tr512多肽的融合蛋白与溶胶凝胶体以静电作用相互结合；所述溶胶凝胶体水解后带有正电荷。
3.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，所述含有tr512多肽的融合蛋白的固载量为1×10-10mol～5×10-10mol；
4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述tr512的氨基酸序列为gggskvilfe gpag rwtwpeise gapg skvilfe ggpg；
5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述功能化修饰的纸基的制备方法包括：将含有溶胶凝胶体的溶液i滴加于纸基的检测区，干燥后将含有融合蛋白的溶液ii添加...
【专利技术属性】
技术研发人员：冯亮，朱明珍，
申请(专利权)人：中国科学院大连化学物理研究所，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。