增强基因免疫效果的载体与方法及其在免疫方面的应用技术

本发明专利技术公开了一种增强基因免疫效果的载体与方法及其在免疫方方面的应用，采用含有嵌合ＤＮＡ的质粒在体内表达可以导向ＡＰＣ表面ＦｃＲ的由抗原及Ｉｇ的Ｆｃ段组成的以肽键联结的融合蛋白，从而增强抗原诱导的体液免疫及细胞免疫效应，通过增强的免疫反应，ＤＮＡ疫苗可以产生更好的保护性或治疗效果，同时，还可以用核酸免疫制备高效价的抗血清。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及基因工程技术中的基因免疫，特别是涉及能增强基因免疫效果的载体与方法及其在抗体生产、疫苗制备及免疫接种方面的应用。本专利技术的原理是根据APC介导B细胞及T细胞免疫反应的基本原理、抗原-抗体复合物增强APC抗原呈递效果的事实，将抗原与Fc段融合，借Fc段将抗原导向APC，从而增强对抗原的免疫反应，并通过这种增强了的免疫反应，使DNA疫苗产生更好的保护性或治疗效果，同时还可以用核酸免疫制备高效价的抗血清。本专利技术所述的APC介导B细胞及T细胞免疫反应的基本原理是通过基因免疫诱导机体产生加强的免疫反应，一般都涉及到多种细胞及分子的复杂过程。DNA疫苗可以通过几个不同的途径诱导机体的免疫系统，其中一个途径是DNA疫苗进入注射部位的细胞(比如肌细胞或上皮细胞)，这些细胞表达并释放疫苗编码的抗原，根据疫苗载体的不同，表达的抗原或者通过分泌过程以完整的蛋白而释放，或者表达在这些细胞的膜表面。假若这些细胞因某种原因而死亡，其表达的蛋白也会释放出来。这些不同来源的细胞外抗原与细胞表面(通过细胞表面IgM或非Ig受体)结合，然后抗原与受体的复合物被吞噬细胞外抗原也可通过胞饮机理进入APC系统。在与APC结合之前、之后或过程中，抗原有被细胞外间隙的蛋白酶降解的可能。总之，DAN疫苗产生的抗原进入APC，在APC内被加工，与MHCI及MHCII型抗原相结合形成抗原-MHC复合物，然后活化CD4+T(Th1及/或Th2)细胞，从而调节免疫反应。由于B细胞的活化、增殖、分化以及其Ig类型转换都需要CD4+T细胞的协助，将抗原以抗原-MHC II复合物的方式呈递给B细胞，对产生抗原特异性抗体至关重要。正就是通过这一途径，DNA疫苗除了具有能够活化CD8+CTL的功能外，还能够刺激CD4+T细胞。另外一个平行的途径是DNA疫苗进入APC或其它组织细胞并表达抗原，抗原在APC胞浆内被蛋白酶降解，由此产生的蛋白片段被TAP-1及TAP-2所识别，转运至粗面内质网(RER)腔，与MHC I形成复合物并表达于APC表面，被具有特异性T细胞受体的CD8+CTL识别，在与其它适当因子的协调下，这种CD8+CTL分化为具有活性功能的CTL。DNA疫苗还可以诱导那些结合了或者吞噬了其编码的抗原的细胞因子。APC与抗原的相互作用会刺激对相关细胞具有正反馈效果的细胞因子，比如使CD4+Th细胞分化增殖为Th1及Th2的细胞因子。因此，在DNA疫苗中除了抗原的基因外，有的还包括一种或几种编码细胞因子的基因。总之，B细胞参与体液免疫，产生抗体；T细胞参与细胞免疫并辅助B细胞成为可以产生抗体的浆细胞。一个高效价、长期的保护性免疫需要T细胞的活化。其它免疫活性细胞包括巨噬细胞、单核细胞、以及其它APC在介导B细胞的成熟、T细胞的活化等免疫反应中也起着至关重要的作用。不同的APC可以诱导T细胞不同程度的反应。之所以有这种量上的差别，其释放的细胞因子的作用不可忽视。本专利技术所述的抗原-抗体复合物增强APC抗原呈递效果的事实为疫苗的免疫效果取决于对淋巴细胞的抗原呈递的有效性。由于网状内皮细胞可以通过激活静态T细胞而诱发初次免疫反应，因此网状内皮细胞具有抗原呈递效果。将抗原导向APC上的特异性受体可以影响抗原在细胞内的加工过程，从而也会影响到所产生的多肽片段的性质，以及这些片段与MHC I、MHC II分子结合的效果，还有它们刺激的T细胞的类型。所以，将抗原特异地导向APC是增强疫苗免疫效果的有力措施。本专利技术所述的增强对抗原的免疫发应的原理是抗原和其它可与APC表面结合的导向分子相连接可增强APC对抗原的摄取。这些导向分子包括C3b、β-2微球蛋白、IgFc受体特异性抗独特型抗体、以及MHC II型分子等。免疫球蛋白Fc片段可与APC以及B细胞表面的特异性Fc受体(FcR)相结合。Fc片段位于每一免疫球蛋白的重链恒定区，由铰链区一部分、CH2、及CH3功能区组成。不同类型的免疫球蛋白的Fc段的DNA序列具有交叉同源性。单核细胞及网状内皮细胞等APC细胞表面的FcR介导的抗原呈递反应具有不可忽视的作用，它们可以有效地引起T细胞的活化。当抗原-抗体复合物与单核巨噬细胞表面的FcR结合后，抗原进入细胞内，接着被加工、呈递，使其活化T细胞的效应大大增强，只需1/100至1/10的抗原量就可引起同样强大的T细胞反应。本专利技术的具体技术方案如下本专利技术是采用含有嵌合DNA的质粒在体内表达可以导向APC表面FcR的由抗原及Ig的Fc段组成的以肽键联结的融合蛋白，并用编码抗原的核酸免疫。本专利技术所述的嵌合DNA分子是插在含有蛋白转录及翻译的调控序列的真核表达载体中的，比如启动子及多聚A等；嵌合DNA分子含有SP、IE、靶蛋白(抗原)及Fc。本专利技术所述的Fc段来源于不同类型的免疫球蛋白的重链恒定区包括铰链区在内的C-端部分，其含有与FcR全部或者部分结合序列的结合位点，能与抗原融合并将其导向B细胞及APC而促进APC对抗原的摄取及加工。本专利技术所述的靶抗原包括病毒、细菌抗原、真菌抗原、原虫及其它寄生虫抗原、肿瘤抗原、自身免疫性抗原、过敏性抗原、移植排斥抗原、任何异源性(抗原性)蛋白质等。本专利技术嵌合DNA分子的SP是位于融合蛋白N-端的任何蛋白的信号肽，有助于融合蛋白的翻译、加工、转运及释放。分泌的蛋白质经多肽酶的作用除去SP。本专利技术嵌合DNA分子的IE是由T细胞抗原位点组成并位于SP之后激活T细胞。如果抗原本身含有SP，则可直接将抗原与Fc融合而不要载体提供的SP；或者可除去抗原的SP，再将不含SP的抗原与载体的SP-IE相连。如果抗原分子足够大，并有较强的T细胞位点，可不要载体上的IE。如果抗原是个小分子并缺乏T细胞位点，载体上的IE就会起到很大的作用。本专利技术所述的载体是指由常规真核表达载体所具有的关键构件和抗原与Fc段的融合体之前的一个信号肽片段SP及一个免疫增强片段IE组成，本专利技术将上述载体称为pseFc(见附图说明图1)。本专利技术所述的常规真核表达载体是指任何含有抗原及Fc、可以自我复制、含有基因表达以及质粒在原核细胞内增殖的关键部件的核酸序列，包括线型核酸、质粒、噬菌体及各种不同的DNA和/或RNA病毒载体。本专利技术所述的蛋白质是指由肽键联在一起的与长度及翻译后是否修饰(如糖基化、磷酸化)无关的两个或两个以上的氨基酸。本专利技术所述的编码抗原的核酸片段是指编码已知的和/或未知的蛋白的基因片段，比如病原体抗原以及肿瘤抗原等，抗原可以是一个，也可以是多个同源或异源性抗原的串联。本专利技术所述的机体包括啮齿类及非啮齿类，即所有的脊椎动物，如灵长类及人类。本专利技术在免疫方面的应用如下A、通过将来自同属或者不同种属的编码抗原的基因片段与编码免疫球蛋白Fc段的基因片段可以前后顺序互换地连接到一起，诱导机体对抗原产生高效的细胞免疫反应及保护性抗体反应。B、通过非蛋白类抗原在体内制备出用于科研或者疾病的诊断和治疗的抗体。C、通过在体内表达的抗原-Fc融合体来直接制备不需在体内表达及纯化的已知抗原的抗体或者未知抗原的抗体。D、通过核酸免疫制备高效价的抗血清。附图及图面说明图1 pseFc载体结构示意2 HIV-1gp120基因疫苗结构示意3 HIV-1gp120 诱导的抗体反应图4 HIV本文档来自技高网...

【技术保护点】
增强基因免疫效果的载体与方法及其在免疫方面的应用，其特征在于：采用含有嵌合ＤＮＡ的质粒在体内表达可以导向ＡＰＣ表面ＦｃＲ的由抗原及Ｉｇ的Ｆｃ段组成的以肽键联结的融合蛋白，并用编码抗原的核酸免疫。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：余力，张明杰，
申请(专利权)人：余晓红，
类型：发明
国别省市：90[中国|成都]