高效生产重组腺病毒伴随病毒的病毒载体、细胞系、方法及其组成的生产系统技术方案

一种高效生产重组腺病毒伴随病毒的病毒载体，其特征在于：该病毒载体为重组杆状病毒载体，在该载体中构建有腺病毒伴随病毒的Ｃａｐ基因、Ｒｅｐ基因和ＩＴＲ序列这三者中的一个或几个，其中ＩＴＲ序列间均包含真核启动子、多克隆位点或目标基因。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及高效生产重组腺病毒伴随病毒的病毒载体、细胞系、方法及其组成的生产系统，属于病毒基因工程领域。
技术介绍
在基因治疗研究中，rAAV载体由于其宿主范围广、副作用小、可介导目的基因长时间稳定表达等特点而获得广泛应用。但是rAAV大规模制备是限制其在基因治疗中广泛应用的主要因素，这可以从提高单个细胞产生病毒颗粒数目和培养大量生产病毒的细胞来大规模制备rAAV。目前的生产技术中，利用哺乳动物细胞，病毒的产量一般仅100病毒颗粒/细胞。经过大量优化后，病毒产量可达104病毒颗粒/细胞，但是生产用的细胞系主要是人胚肾293细胞等贴壁细胞，这些细胞大规模培养比较困难，因此重组病毒仍难以进行大规模生产。近年来有研究者使用杆状病毒表达AAV辅助蛋白，在昆虫细胞中生产rAAV病毒，据报道可达105/细胞。昆虫细胞系(如Sf9细胞)适合悬浮培养，可以在细胞培养罐中大量培养，有利于rAAV病毒的大规模生产。目前使用的昆虫系统中，需要使用三个重组杆状病毒载体，分别表达rAAV的Rep、Cap及ITR，其感染过程仍较繁杂。
技术实现思路
本专利技术的第一个目的是提供高效生产重组腺病毒伴随病毒的病毒载体。本专利技术的另一个目的是提供高效生产重组腺病毒伴随病毒的细胞。本专利技术的第三个目的是提供高效生产重组腺病毒伴随病毒方法。本专利技术的第四个目的是提供高效生产重组腺病毒伴随病毒的生产系统。为实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案一种高效生产重组腺病毒伴随病毒的病毒载体，该病毒载体为重组杆状病毒载体，在该载体中构建有腺病毒伴随病毒的Cap基因、Rep基因和ITR序列这三者中的一个或几个，其中ITR序列间均包含真核启动子、多克隆位点或目标基因。杆状病毒目前常用的是苜蓿银纹夜蛾核多角体病毒AcMNPV和家蚕杆状病毒BmPV，本专利技术所使用的是苜蓿银纹夜蛾核多角体病毒AcMNPV。使用杆状病毒，可以在昆虫细胞中高效、按比例的表达腺相关病毒的有关蛋白；ITR序列提供了腺病毒相关病毒的包装信号、整合启动子、以及可克隆外源基因的多克隆位点；Rep提供了腺病毒相关病毒复制所需的酶；Cap基因提供了病毒包装所需的结构蛋白。所述的重组杆状病毒载体中构建有腺病毒伴随病毒的Cap基因。所述的重组杆状病毒载体中构建有腺病毒伴随病毒的Rep基因和Cap基因。所述的重组杆状病毒载体中构建有腺病毒伴随病毒的ITR序列。所述的重组杆状病毒载体中构建有腺病毒伴随病毒的Cap基因和ITR序列。所述的重组杆状病毒载体中构建有腺病毒伴随病毒的Rep基因、Cap基因和ITR序列。一种高效生产重组腺病毒伴随病毒的细胞系，该细胞系为整合昆虫细胞系，在该细胞系的染色体中整合有腺病毒伴随病毒的Cap基因、Rep基因和ITR序列这三者中的一个或几个，其中ITR序列间均包含真核启动子、多克隆位点或目标基因。昆虫细胞系是杆状病毒的主要宿主细胞，容易培养，有利于提高重组腺病毒相关病毒的生产效率和产量；目前常用的有3个细胞株Sf9和Sf21以及High-FiveTM，都是商业化的细胞系。将腺病毒相关病毒的有关序列整合到昆虫细胞的染色体上后可避免反复使用重组杆状病毒感染昆虫细胞。所述的整合昆虫细胞系的染色体上整合有腺病毒伴随病毒的Rep基因。所述的整合昆虫细胞系的染色体上整合有腺病毒伴随病毒的ITR序列。所述的整合昆虫细胞系的染色体上整合有腺病毒伴随病毒的Rep基因和ITR序列。一种高效生产重组腺病毒伴随病毒的方法，利用上述重组杆状病毒载体感染昆虫细胞系或利用上述重组杆状病毒载体感染上述整合昆虫细胞系，高效生产重组腺病毒伴随病毒。所述的杆状病毒载体为苜蓿银纹夜蛾核多角体病毒AcMNPV。利用上述方法得到的高效生产重组腺病毒伴随病毒生产系统，该系统由重组杆状病毒载体和昆虫细胞系组成，或由重组杆状病毒载体和整合昆虫细胞系组成。所述的杆状病毒载体为苜蓿银纹夜蛾核多角体病毒AcMNPV。所述的重组腺病毒伴随病毒生产系统由昆虫细胞系Sf9或Sf21或High-FiveTM、构建有腺病毒伴随病毒Rep基因和Cap基因的杆状病毒载体和构建有腺病毒伴随病毒ITR序列的杆状病毒载体组成。所述的重组腺病毒伴随病毒生产系统由昆虫细胞系Sf9或Sf21或High-FiveTM、和构建有腺病毒伴随病毒Rep基因、Cap基因和ITR序列的杆状病毒载体组成。所述的重组腺病毒伴随病毒生产系统由整合有腺病毒伴随病毒Rep基因的整合昆虫细胞系Sf9或Sf21或High-FiveTM、和构建有腺病毒伴随病毒Cap基因和ITR序列的杆状病毒载体组成。所述的重组腺病毒伴随病毒生产系统由整合有腺病毒伴随病毒ITR序列的整合昆虫细胞系Sf9或Sf21或High-FiveTM、和构建有腺病毒伴随病毒Rep基因和Cap基因的杆状病毒载体组成。本专利技术的优点是所使用的重组杆状病毒在细胞系中能自行繁殖，可大量提供生产rAAV所需蛋白质或基因组；昆虫细胞系适合悬浮大量培养，大大降低了生产成本；使用一个或两个重组杆状病毒感染昆虫细胞系生产rAAV，更简便易行；同时该体系通过调节有关基因、蛋白质的数量或表达时间，可大大提高生产rAAV的效率。下面结合附图和具体实施方式对本专利技术作进一步说明，并非对本专利技术的限定。附图说明图1为载体pBac-Cap质粒构建图。图2为载体pBac-RC质粒构建图。图3为载体pBac-ITR质粒构建图。图4为载体pBac-Cap-ITR质粒构建图。图5为载体pBac-Cap-Rep-ITR(pAllinOne)质粒构建图。图6为载体pIB-Rep质粒构建图。图7为载体pIB-Cap-Rep质粒构建图。图8为载体pIB-ITR质粒构建图。图9为rAAV-LacZ感染人胚肾293细胞后LacZ表达检测图。具体实施例方式实施例1、携带和表达AAV cap基因的重组杆状病毒rBac-Cap的构建1、通过DNA合成仪(Applied BioSystem 373A)合成下列引物PCapA5’CGGGATCCTGTTAAGACGGCTGCCGACGGTTATCTACCCGATTGGCTC，其中斜体为BamHI位点，下划线为突变点。第一个ATG突变为ACG以降低VP1的表达水平；第二个读框错位的ATG突变为ACG，以消除对下游VP2及VP3表达的影响。PCapB5’ACAAGCTTACAGATTACGAGTCAGGTATCTGG，其中斜体为HindIII位点，下划线为终止密码。2、以质粒pAAV-RC(Stragagene公司产品)为模板，采用Roche高保真PCR体系进行PCR扩增，获得AAV-2的Cap基因。反应条件如下模板1ng，引物P1和P2各100ng，dNTP 0.25mmol/L，反应缓冲液10微升，酶2.5单位，补去离子水至100微升。采用美国PE公司9600型PCR仪进行PCR反应(94℃ 30秒，50℃30秒，72℃ 3分，共扩增30循环。经琼脂糖电泳获得2.3kb DNA片段。3、上述获得的DNA片段及载体质粒pFastBacDual(invitrogen公司产品)各200ng用BamHI+HindIII(均为Promega公司产品)进行酶切，回收片段用T4 DNA连接酶(Promega公司产品)连接，16℃ 6小时后，本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：赵春文，周志文，李月娟，冯宇霞，魏玲，
申请(专利权)人：北京三诺佳邑生物技术有限责任公司，
类型：发明
国别省市：