组织工程自体复合皮肤及其制备方法技术

一种组织工程自体复合皮肤，其特征在于：该复合皮肤由附着于纤维蛋白生物支架上的自体真皮细胞层和自体表皮细胞层构成。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种，属于组织工程领域。
技术介绍
组织工程技术是国际上于一九八零年后建立起来的一种用于制备可移植的、具备形态特征和功能的组织与器官的高新技术，目前国际上正在研发的产品有皮肤、真皮、粘膜、肌腱、骨、软骨、血管、神经、角膜、心脏瓣膜、肾脏、腺体和消化器官等，而最先获得成功的是皮肤组织、真皮组织和软组织。皮肤和真皮组织是最先于1999年获得美国FDA认证的产品，其中包括Apligraf、Integraf和Dermagraf三种产品。由于组织工程技术制备的组织器管中包含有活的细胞以及可能的生物可降解材料，产品可用于体表或移植于体内，鉴于此类产品不同于以往的生物制品、化学药品、器械等，美国FDA在认证过程中成立了新的专门审批小组，由器械审批处牵头，以器械类审批。美国FDA批准的同种异体细胞生产的组织工程皮肤在临床使用，短期内具有较好的临床效果，但仍然存在三个方面的问题第一，由于异体的排异反应使其存活周期短；第二，其支架吸收慢不利于创面愈合；第三，由于是单独的上皮细胞，愈合后的皮肤很薄，易破碎，导致新的创伤。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种组织工程自体复合皮肤。本专利技术的另一个目的是提供组织工程自体复合皮肤的制备方法。本专利技术的第三个目的是提供这种组织工程自体复合皮肤的应用。为实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案一种组织工程自体复合皮肤，该复合皮肤由附着于纤维蛋白生物支架上的自体真皮细胞层和自体表皮细胞层构成。所述的自体真皮细胞层是将来源于患者自体的真皮成纤维细胞经体外扩增、培养得到的。所述的自体表皮细胞层是将来源于患者自体的表皮干细胞经体外扩增、培养得到的。表皮干细胞在培养过程中分裂形成表皮干细胞和TA细胞(transientamplifying cell)，其中表皮干细胞具有增殖能力，TA细胞具有分化能力，分化成为上皮细胞，构成表皮层。所述纤维蛋白为人的纤维蛋白。这种支架的优点在于第一、能支持表皮细胞和真皮细胞的扩增；第二，该支架能较快的被吸收；第三，其支架柔软，可折皱，容易操作，第四，有较强的粘附性，易于附着于创伤面。一种组织工程自体复合皮肤的制备方法，是将来源于患者自体的表皮干细胞和真皮成纤维细胞在体外扩增和分化，再将表皮细胞后种植于含有患者自体真皮成纤维细胞的纤维蛋白生物支架上，进行培养，在体外构建组织工程自体复合皮肤。所述含有患者自体真皮成纤维细胞的纤维蛋白生物支架的构建方法是采用人的纤维蛋白原为材料，按照浓度为1-8mg/ml，加入人的凝血因子1-5unit/ml和CaCl21-5μmol/ml，同时加入真皮成纤维细胞，室温下混合，立刻构建于培养皿上；加DMEM和10％FBS培养基培养。所述种植是指将来源于患者自体的表皮细胞以10倍于已使用的成纤维细胞的量加入构建有生物支架的培养皿中。所述加入真皮成纤维细胞的数量为40000-60000细胞/ml。所述的组织工程自体复合皮肤，用于制备皮肤移植用的生物材料。组织工程自体复合皮肤采用自体上皮细胞和真皮细胞在体外扩增后，接种到可降解的皮肤支架上进行培养，在体外构建组织工程皮肤，其和天然皮肤具有类似的结构和功能。然后在移植到病人自体，用于大面积烧伤患者和皮肤溃疡患者的皮肤移植和修复。该制品组织结构近似于或等同于人的皮肤组织，采用患者自体细胞，不存在免疫排斥反应和传染性疾病的交叉传染问题，是目前治疗皮肤烧伤病人非常有效的方法。可以广泛应用于治疗皮肤烧伤、溃疡、创伤等多种原因造成的皮肤缺损，尤其是能用于大面积皮肤烧伤的急救。本专利技术能在短时间内为患者提供大面积的表皮和真皮细胞，供移植使用，其优点在于1、为自体皮肤细胞构建，因而无排异反应，细胞再形成的组织成活时间长。2、采用的生物支架粘附性好，在上皮细胞和真皮细胞移植后成活率高，创伤面修复快。3、该生物工程复合皮肤既有上皮细胞，又有构成其真皮组织的成纤维细胞，因而其皮肤创伤愈合皮肤结实，不易破碎，愈合效果好，外观更正常。下面结合附图和具体实施方式对本专利技术作进一步说明。附图说明图1为本专利技术的成品外观2为患者进行皮肤移植前的局部皮肤状况3为皮肤移植后的局部皮肤状况图具体实施方式在确定取皮肤组织之前，由具有执业医师资格的医务人员向患者或患者家属解释原因，争得患者或家属同意，皮肤的取材部位由具有执业医师资格的医务人员确定，并按照医院规定的手术原则取材。患者进行体检和化验，包括常规检验、传染病病原(如HIV、肝炎病毒等)的检查。所取的皮肤立即由专业人员放入无菌容器内，并立即冷藏(10℃以下)，然后按规定的标准操作程序处理。实施例1、组织工程复合皮肤的制备一.患者自体健康细胞的提取和细胞培养传代(一)患者自体健康细胞的提取1.手术室取材1)用医用碘酊清理患者取皮面；2)用生理盐水冲洗取皮面，除去残留的碘酊；3)取1cm×2.5cm的窄长皮肤；4)取下的皮肤放贮存液中送细胞培养室。2.取材后皮肤组织的保存用5ml含有100单位/ml青霉素和100mg/ml的链霉素的DMEM(购于美国Hyclone公司)培养液于保存管中保存组织(4℃)。3.在超净工作台中消毒、清洗，组织大块分离用含100单位/ml青霉素和100mg/ml的链霉素的0.1M PBS冲洗组织，修剪多余的脂肪和皮下结绨组织。将组织剪成1cm×1cm的组织块。4.组织消化(Sony CO2培养箱)将3～4块1cm×1cm表皮组织块和真皮组织块分别放置于60mm培养皿中加入10ml浓度为0.25％的胰酶/EDTA液，37℃，120分钟；DMEM+10％FBS培养液终止。5.细胞分离将消化后的组织块剪碎并用吸管打散。6.离心吹散后的细胞收集至离心管中，Backman公司控温离心机，25℃，1000转/min，离心5分钟，弃去上清液。7.细胞鉴定1)形态学采用倒置光学显微镜观察。上皮细胞多呈多角型，角为钝角，细胞呈圆性；细胞外观透明，细胞紧密联结成单层，也可呈管状生长。真皮成纤维细胞质向外伸出2-3个长短不同的突起，呈多角形或长棱形。2)细胞表型采用角质蛋白抗体和胶原蛋白抗体(美国ICN公司)进行免疫抗原鉴定，结果显示分离得到的细胞为正常表皮细胞和正常真皮成纤维细胞。3)致癌性采用裸鼠试验，见《美国FDA关于生物制品生产用细胞株鉴定和指控的考虑要点》，结果显示无致癌性。4)无菌检测按《中国生物制品规程》(2000版)通则《生物制品无菌试验规程》A/B项进行，结果符合无菌要求。5)细胞存活率采用台盼蓝(Trypan blue)染色法检查，核染色的细胞为死亡细胞，不着色的细胞为活细胞，计数总细胞数和死细胞数，计算细胞存活率。细胞存活率＝×100％经测定，存活率超过80％。(二)表皮细胞的原代培养与传代1.原代细胞培养在离心管中加入加10ml无血清上皮细胞培养液(Sigma公司，美国)吹悬，接种入4×60mm培养皿；Sony CO2培养箱，37℃，5％CO2，进行培养。2.传代细胞培养每隔2～3天换液1次，上皮细胞达到50-70％汇集细胞后传代。(三)真皮细胞的原代培养与传代1.原代细胞培养在离心管中加入加10ml无血清上皮细胞培养液(Sigma公司，美国)吹悬，接种入4×60mm培养皿；Sony CO2培养箱，37℃，5％CO2，进行培养。2.传代细胞本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：韩斌，田书彦，杜彦侠，张旭，
申请(专利权)人：吕伟光，
类型：发明
国别省市：