组织工程自体角膜上皮及其制备方法技术

一种组织工程自体角膜上皮，其特征在于：它由纤维蛋白生物支架和附着在其上的来源于患者自体的角膜上皮干细胞和角膜上皮细胞构成。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种，属于组织工程领域。
技术介绍
据统计，我国每年有400～500万角膜病患者在等待着角膜移植，但由于受传统思想的影响，捐献角膜者甚少，导致患者需要长时间等待方可得到适宜的角膜，延误了治疗。为解决这个问题，人们专利技术了生物工程角膜，将从胚胎角膜缘组织或者另一侧眼睛的角膜缘获得的角膜干细胞在体外培养至第三、四代时构建在一个生物支架上，共同构成角膜上皮。可用于治疗各种原因导致的角膜损伤、脱落病人的角膜移植。经过临床观察，胚胎干细胞因为是异体的，几乎不能达到任何效果；而采用自体的角膜缘的上皮细胞构建于羊膜上的生物工程复合皮肤经过几百例的临床试验，总有效率达到75％，病人视力和功能恢复良好。但是，这种生物工程角膜上皮还存在着许多不足首先、由于生物工程角膜的角膜干细胞来源于于异体的胚胎角膜缘组织，而角膜干细胞最终要存活于患者的角膜缘中，该部位具有免疫细胞，因而无法避免免疫排斥反应，导致移植失败。第二、生物支架采用胶原蛋白、隐形眼镜或羊膜，导致角膜干细胞和上皮细胞在其表面难以均匀生长，手术后降解速度缓慢，因而限制了临床应用。以前的这种角膜缘细胞的生长都采用了鼠源性滋养层细胞，有潜在的非人类来源的传染，同时采用了胎牛血清作为培养基，又易于传染牛的传染病等。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种组织工程自体角膜上皮。本专利技术的另一个目的是提供这种组织工程自体角膜上皮的制备方法。本专利技术的第三个目的是提供这种组织工程自体角膜上皮的应用。为实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案一种组织工程自体角膜上皮，它由纤维蛋白生物支架和附着在其上的来源于患者自体的角膜上皮干细胞和角膜上皮细胞构成。角膜上皮干细胞取自患者角膜缘部位，具有增殖能力，经培养，分裂为角膜上皮干细胞和TA细胞(transientamplifying cell)。TA细胞具有分化能力，分化成为角膜上皮细胞。所述的角膜上皮干细胞和角膜上皮细胞是由来源于患者自体的角膜干细胞经体外扩增、培养得到的。如果一个病人只有一侧眼角膜出现损伤，就用其另一侧的角膜缘作为供体，取1-2平方毫米的角膜缘组织，进行体外的增殖培养，将培养传代至第三、四代时的上皮细胞建于生物支架上，继续培养，进行移植。所述纤维蛋白为人的纤维蛋白，它作为组织工程自体角膜上皮的生物支架，能支持角膜上皮干细胞和角膜上皮细胞的增殖并能保持干细胞特征，该支架能较快地被吸收，降解速度快，并且柔软，可折皱，便于手术操作。一种制备组织工程自体角膜上皮的方法，是将来源于患者自体的角膜上皮干细胞在体外扩增和分化后，接种到纤维蛋白生物支架上进行培养，在体外构建组织工程自体角膜上皮。所述接种到纤维蛋白生物支架上进行培养是指采用人的纤维蛋白原为材料，按照浓度为1-8mg/ml，加入1-5unit/ml人的凝血因子和1-5μmol/mlCaCl2，同时加入40000-60000个传代角膜培养细胞，室内温下混合，立刻构建于35mm的培养皿上，形成附着有自体角膜上皮干细胞和自体角膜上皮细胞胞的生物支架；在培养皿中加入2ml角膜细胞培养液，Sony CO2培养箱，37℃，5％ CO2，继续培养。组织工程自体角膜上皮，用于制备角膜移植用的生物材料，可移植到病人损伤角膜表面，从而修复和恢复角膜功能。本专利技术的有益效果在于一、降低或消除了免疫排斥反应，成功分离出角膜干细胞，并在体外快速增殖、分化，并且具有正常角膜上皮干细胞和上皮细胞的特征和功能。二、无传染性疾病的交叉传染问题细胞培养过程不使用非人类来源的动物细胞滋养层和培养基，避免了传染性疾病的发生。三、新的生物支架能很好的支持角膜干细胞、上皮细胞的增殖分泌，并且该生物膜吸收迅速，从而病人愈合速度明显加快(从以往可四个月减少到一个月)。四、手术操作简便克服了以往产品难以辨认细胞生长面和需要多针缝合的问题。下面结合附图和具体实施方式对本专利技术作进一步说明。附图说明图1为本专利技术成品外观2为患者手术前眼角膜3为移植本专利技术后患者的眼角膜图具体实施方式从正常人的眼角膜中分离出干细胞，进行体外培养、增殖和分化，在二到三周内使这些细胞增殖数百万倍，然后将这些带有干细胞的上皮细胞种在一种生物膜上，从而长成生物工程角膜，将其移植到角膜损伤病人的病变部位，进行修复，使病人视力恢复。实施例1、组织工程自体角膜上皮的制备在确定取角膜组织之前，由具有执业医师资格的医务人员向患者或患者家属解释原因，争得患者或家属同意，角膜上皮的取材部位由具有执业医师资格的医务人员确定，并按照医院规定的手术原则取材。患者进行体检和化验，包括常规检验、传染病病原(如HIV、肝炎病毒等)的检查。所取的角膜上皮立即由专业人员放入无菌容器内，并立即冷藏(10℃以下)，然后按规定的标准操作程序处理。一、角膜上皮组织样品处理及细胞培养传代(一)提取健康细胞1.手术室取材(百级空气净化)从患者的另一侧正常眼角膜缘由专业医生取1×1mm组织块。2.所取的角膜组织的保存用含的DMEM培养液的15ml保存管中保存组织(4℃)。3.在超净工作台中消毒、清洗，组织剪碎用含100单位/ml青霉素和100mg/ml的链霉素的PBS冲洗组织3次，修剪多余的脂肪和皮下结绨组织。4.组织消化(Sony CO2培养箱)将1mm×1mm组织块放置于35mm培养皿中加入浓度为0.05％的胰酶/EDTA液，消化。DMEM+FBS(美国Hyclone公司)培养液终止。5.细胞分离将消化后的组织块剪碎并用吸管打散。6.离心吹散后的细胞收集至离心管中，Backman公司控温离心机，25℃，1000转/min，离心5分钟，弃去上清液。7.细胞鉴定1)形态学采用倒置光学显微镜观察。细胞多呈多角型，角为钝角，细胞呈圆性。细胞外观透明，细胞紧密联结成单层或多层。为典型正常的角膜上皮细胞。2)细胞表型采用Keratin角质蛋白3的抗体(美国ICN公司)进行细胞免疫抗原结合反应，鉴定为典型正常的角膜上皮细胞。3)致癌性采用裸鼠试验，见《美国FDA关于生物制品生产用细胞株鉴定和指控的考虑要点》，结果无致癌性。4)无菌检测按《中国生物制品规程》(2000版)通则《生物制品无菌试验规程》A/B项进行，结果符合无菌要求。5)细胞存活率采用台盼蓝(Trypan blue)染色法检查，核染色的细胞为死亡细胞，不着色的细胞为活细胞，计数总细胞数和死细胞数，计算细胞存活率。细胞存活率＝×100％经测定，细胞存活率超过80％。(二)细胞培养传代1.细胞培养在离心管中加入角膜无血清培养液(美国Sigma公司)，接种入1×35mm培养皿，Sony CO2培养箱，37℃，5％ CO2，进行培养。2.细胞传代每隔2～3天换液1次，上皮细胞达到50～70％汇集细胞后传代。二、构建组织工程自体角膜上皮(一)制备1.制备人纤维蛋白原用200ml血浆在4℃离心，3500转/min，离心30分钟，弃上清液，加10ml注射用水，制成悬浊液，保存备用。2.构建角膜上皮1)采用人的纤维蛋白原为材料，按照浓度为1-8mg/ml，加入1-5unit/ml人的凝血因子(购于Sigma公司)和1-5μmol/ml钙离子(CaCl2)，同时加入50000个传代至第三代的细胞，室内温下混合，立刻构建于35mm的培养皿上，形成附着有自体角本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：韩斌，田书彦，杜彦侠，张旭，
申请(专利权)人：吕伟光，
类型：发明
国别省市：