角膜上皮片及其制作方法技术

提供具有类似角膜上皮的细胞层的角膜上皮片。进行如下步骤得到角膜上皮片：ａ）分别调制作为自体细胞的第１细胞以及与该第１细胞来源不同的第２细胞的步骤；ｂ）把上述第１细胞以及上述第２细胞播种于胶原层上进行培养的步骤；ｃ）上述第１细胞以及上述第２细胞增殖形成细胞层后，把该细胞层的最表层与空气进行接触的步骤。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及。本专利技术可用于需要移植角膜上皮的疾病(眼表面疾病)的治疗上。本专利技术尤其对双眼性的角膜性疾病提供有效的治疗手段。
技术介绍
对于角膜被结膜上皮被覆而产生混浊的眼表面疾病，作为外科治疗目前施行角膜上皮移植术。但是，对于伴有严重炎症的难治性角结膜疾病(史蒂芬强森(Stevens-Johnson)综合征或眼类天疱疮、角膜腐蚀等)来说，其预后是非常不良的。其最大的原因，可以举出具有强抗原性的异体(allo)的角膜上皮被宿主的免疫系统所识别而受到排斥。尤其是，为了预防排斥反应而在术后将大量的免疫抑制剂全身或局部给药所致的合并症也成为其预后不良的重要原因。另一方面，在使用异体的角膜上皮的情况下，有供者不足的问题。因而，不用异体而用自体的角膜上皮组织进行移植被认为是很理想的。但是，在单眼性的疾病(角膜腐蚀等)中，曾见过用健康眼的角膜上皮移植到患眼中从而收到良好效果的报告，可是难治性角膜疾病的多数为双眼性，故实际上不能用这种方法。另一方面，至今对于不适宜角膜移植的史蒂芬强森(Stevens-Johnson)综合征或眼类天疱疮、化学外伤、复发性翼状胬肉等的难治性角结膜疾病，作为外科治疗法，本专利技术者从平成11年以来，实施了以被京都府立医科大学伦理委员会承认的羊膜为基质的培养角膜上皮移植术获得了比较良好的治疗效果(参考非专利文献1～3)。另外，从平成14年以来，实施了京都府立医科大学的以人类为对象的、被医学研究审查委员会承认的培养自体口腔粘膜上皮移植术，使治疗效果得到提高(参考专利文献1、非专利文献4)。专利文献1国际公开第03/043542号小册子非专利文献1Noriko Koizumi et al.，Ophthalmology 2001；1081569-74。非专利文献2Noriko Koizumi et al.，Arch Ophthalmol2001；119298-300。非专利文献3Nakamura T et al.，Cornea.22；70-712003。非专利文献4Nakamura T et al.，Invest Ophthalmol Vis Sci.2003；44106-16。
技术实现思路
由于难治性角结膜疾病多数为双眼性，以羊膜为基质的培养角膜上皮移植术治疗法的多数不得不依赖利用他人(allo)的组织，因此排斥反应或细菌感染症等的问题大大影响术后效果是目前的现状。另外，通过培养自体口腔粘膜上皮移植手术的治疗法，虽可以使用自体(auto)口腔粘膜而可以避免排斥反应等危险性，但是有培养上皮片的透明性的问题或者在术后有产生血管新生等病例，期待着今后开发出更好的治疗法。以上的情况中，本专利技术者们探索了用自体组织进一步发展眼表面再建术的可能性。结果想出了如下的新方法将自体的细胞，以及与其来源不同的细胞组合培养使其杂交化，从而由此构建角膜上皮样的粘膜上皮层。这里，尝试了选择口腔粘膜上细胞作为自体细胞，另一方面选择角膜上皮细胞作为与其来源不同的细胞来构建角膜上皮片时，确认了来自二种细胞的细胞杂交化形成的细胞群，形成与角膜上皮类似的分化、重层化的粘膜上皮层。另外，用动物移植实验确认了这样得到的粘膜上皮层保持眼表面的恒常性，并且具备良好的存活性。这里，活体中存在各种各样的粘膜上皮组织，它们具有粘膜上皮特有的许多共同点。考虑这一情况，认为例如即使是结膜上皮细胞、鼻腔粘膜上皮细胞等、构成其他粘膜组织的细胞，也可以与口腔粘膜上皮细胞同样，作为用于形成如上所述角膜上皮样的粘膜上皮层的自体细胞而利用。尤其是，结膜上皮细胞是构成角膜上皮近邻组织的细胞，因而可以考虑为有效的细胞源。还有，一般来说，形成组织的细胞通过接受外部信号等而由其前体细胞或进而是未分化的细胞所生成。综合考虑这些情况，认为只要具有向上述细胞(口腔粘膜上皮细胞、结膜上皮细胞等)分化能力的，即使是未分化的细胞，也可以与这些细胞同样，作为形成粘膜上皮层时的自体细胞而使用。另外，如后述的实施例所示，实验确认了即使将人的口腔粘膜上皮细胞和人羊膜上皮细胞杂交化的情况下，也可能形成类似角膜上皮的粘膜上皮层。即，判明了即使使用角膜上皮以外的细胞作为组合细胞，与作为自体细胞的口腔粘膜上皮细胞进行杂交化的时候，也可以形成角膜上皮样的粘膜上皮层。由此想到了构成角膜上皮的近邻组织的结膜上皮细胞，与羊膜上皮细胞同样是可以使用的细胞的一个有力候补。如上所述，本专利技术者们精心研究的结果是，以实验确认了培养包括自体细胞的二种以上的细胞，使其杂交化，从而可构建角膜上皮样的粘膜上皮层。本专利技术基于以上的成果，提供以下构成。即，作为本专利技术第一部分，提供如下的角膜上皮片备有包含作为自体细胞的第1细胞和与该第1细胞来源不同的第2细胞的、重层化的细胞层。在本专利技术的一种方式中，前述第1细胞是选自来自口腔粘膜上皮的细胞、来自结膜上皮的细胞、来自鼻腔粘膜上皮的细胞、和来自其他粘膜上皮的细胞、以及来自可以构建这些任何一种粘膜上皮的未分化细胞中的一种以上的自体细胞，前述第2细胞是选自来自角膜上皮的细胞、来自结膜上皮的细胞、以及来自羊膜上皮的细胞中的一种以上的细胞。本专利技术的另一方式是以前述第1细胞为来自口腔粘膜上皮的细胞为特征。本专利技术的又一方式是以前述第2细胞为他人的细胞为特征。本专利技术的再一种方式是以前述第2细胞为来自角膜上皮的细胞或者来自羊膜上皮的细胞为特征。作为本专利技术的其他方式，提供备有前述细胞层以及胶原层的角膜上皮片。在该方式中，在胶原层上形成前述细胞层。胶原层优选来自羊膜或去除上皮的羊膜。本专利技术的角膜上皮片的细胞层优选具有一个以上的以下性状或者特性最表层的细胞没有角化； 最表层的细胞为扁平形状；具有屏障功能。作为本专利技术的第2部分，提供角膜上皮片的制作方法。本专利技术的制作方法包括a)分别调制作为自体细胞的第1细胞，以及与该第1细胞来源不同的第2细胞的步骤；b)把前述第1细胞以及前述第2细胞播种到胶原层上进行培养的步骤；以及c)前述第1细胞以及前述第2细胞增殖形成细胞层后，把该细胞层的最表层与空气接触的步骤。在本专利技术的一方式中，前述第1细胞为选自口腔粘膜上皮细胞、结膜上皮细胞、鼻腔粘膜上皮细胞、及其他粘膜上皮细胞、和可以构建这些任何一种粘膜上皮的未分化细胞中的一种以上的自体细胞，前述第2细胞为选自角膜上皮细胞、结膜上皮细胞、以及羊膜上皮细胞中的一种以上的细胞。本专利技术的另一方式中，使用口腔粘膜上皮细胞作为前述第1细胞。本专利技术的又一方式中，使用他人细胞作为前述第2细胞。本专利技术的再一种方式中，使用角膜上皮细胞或羊膜上皮细胞作为前述第2细胞。前述步骤b可以在以下任何一种条件下实施。1)在支持细胞的共存下；2)在支持细胞的共存下，并且在支持细胞和前述胶原层之间存在不能通过支持细胞的孔径的隔离膜的状态。前述胶原层优选来自羊膜或去除上皮的羊膜。附图说明 是模式地表示在羊膜上培养口腔粘膜上皮细胞和角膜上皮细胞时的器具等的状态的剖面图。在培养皿1里面静置培养插入容器2，在培养皿1底面形成3T3细胞层5。另外，表示在培养插入容器2的底面上静置羊膜3、在其上培养口腔粘膜上皮细胞和角膜上皮细胞4的状态。符号6是培养基。1培养皿(culture dish、第1容器)，2培养插入容器(cultureinsert、第2容器)，3羊本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种角膜上皮片，其特征为，备有包含作为自体细胞的第１细胞和与该第１细胞来源不同的第２细胞的、重层化的细胞层。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】JP 2004-6-30 192703/20041.一种角膜上皮片，其特征为，备有包含作为自体细胞的第1细胞和与该第1细胞来源不同的第2细胞的、重层化的细胞层。2.根据权利要求1中所述的角膜上皮片，其特征为，上述第1细胞是选自来自口腔粘膜上皮的细胞、来自结膜上皮的细胞、来自鼻腔粘膜上皮的细胞、和来自其他粘膜上皮的细胞以及来自可以构建这些任何一种粘膜上皮的未分化细胞中的一种以上的自体细胞；上述第2细胞是选自来自角膜上皮的细胞、来自结膜上皮的细胞以及来自羊膜上皮的细胞中的一种以上的细胞。3.根据权利要求2中所述的角膜上皮片，其特征为，所述第1细胞是来自口腔粘膜上皮的细胞。4.根据权利要求2或3中所述的角膜上皮片，其特征为，所述第2细胞是他人的细胞。5.根据权利要求2～4中任意一项所述的角膜上皮片，其特征为，所述第2细胞是来自角膜上皮的细胞或来自羊膜上皮的细胞。6.根据权利要求1～5中任意一项所述的角膜上皮片，其特征为，进一步备有胶原层，在该胶原层上形成所述细胞层。7.根据权利要求6中所述的角膜上皮片，其特征为，所述胶原层是来自羊膜或去除上皮的羊膜。8.根据权利要求1～7中任意一项所述的角膜上皮片，其特征为，所述细胞层备有一个以上的以下性状以及特性最表层的细胞没有角化；最表层的细胞是扁平形状；具备屏障功能...

【专利技术属性】
技术研发人员：木下茂，中村隆宏，
申请(专利权)人：阿如布勒斯特有限公司，木下茂，
类型：发明
国别省市：JP[日本]