用于形成角膜上皮的细胞片、及其制造方法和使用方法技术

本发明专利技术的课题是提供对前眼部组织附着性良好的用于形成角膜上皮的细胞片。针对于此，在特定的条件下，在用０～８０℃的温度范围内水合力变化的温度响应性聚合物覆盖基材表面而成的细胞培养支持体上培养用于形成角膜上皮的细胞，根据需要使培养细胞多层化，之后，（１）使培养液温度在上限临界溶解温度以上或下限临界溶解温度以下，（２）将所培养的用于形成角膜上皮的细胞紧密贴合在载体上，（３）将其连同载体一起剥离，由此制造了用于形成角膜上皮的细胞片，从而解决了上述课题。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及在生物学、医学等领域中，用于形成角膜上皮的细胞片、其制造方法和使用它们的治疗方法。
技术介绍
随着医疗技术的显著发展，近年来，用他人的器官替换难以治疗的器官的器官移植得到了普遍化。成为移植对象的器官十分多样，包括皮肤、角膜、肾脏、肝脏、心脏等，并且术后的疗程也变得格外良好，因此已被确立为医疗的一种技术。作为一个例子举出角膜移植，约40年前在日本也设立了角膜银行并开始了移植工作。但是，由于角膜捐献者人数很少，相对于仅国内每年需要角膜移植的患者就有约2万人来说，实际上能够进行移植治疗的患者只有其1/10，约2000人左右。现在的情况是尽管角膜移植的技术已被大致确立，但由于角膜捐献不足的问题，所以需要寻找下一种医疗技术。基于这样的背景，从过去开始，将人工替代物和培养细胞使之组织化而成的移植物直接移植的技术受到关注。其代表性的例子可以举出人工皮肤和培养皮肤。但是，使用合成高分子的人工皮肤具有产生排斥反应等的可能性，作为移植用皮肤不能令人满意。另一方面，由于培养皮肤是将患者本人的部分正常皮肤培养到所希望的大小，因此使用它不需担心排斥反应等，可以说是最自然的掩蔽剂。一直以来，这样的细胞培养是在玻璃表面上或在经过种种处理的合成高分子的表面上进行的。例如，进行了如Y射线照射、硅酮涂布等表面处理的各种聚苯乙烯材质容器等作为细胞培养用容器得到普及。使用这样的细胞培养用容器培养、增殖的细胞，通过用胰岛素之类的蛋白分解酶或化学药品进行处理而被从容器表面剥离、回收。但是，实施如上所述的化学药品处理来回收增殖的细胞时，处理工程繁杂，混入杂质的可能性大，并且增殖的细胞经过化学处理而转化或受到损伤、细胞原有的机能受到损害，具有如上等缺点。为了克服上述缺点，至今提出了若干技术方案。日本专利特公平2-23191号公报中记载了制造可以移植角蛋白组织的膜的方法，其特征为，在角蛋白组织的膜可以在容器表面上形成的条件下，在培养容器中培养源自人新生儿的角化表皮细胞，使用酶来剥离角蛋白组织的膜。具体而言，公开了这样的技术将3T3细胞作为饲养层使其增殖、多层化，使用作为蛋白质分解酶的分散剂回收细胞片。但是，该公报中所记载的方法具有如下缺点(1)分散剂源自菌，所回收的细胞片必须充分地洗净。(2)所培养的每种细胞其分散剂处理条件都不同，而且对该处理必须熟练。(3)通过分散剂处理来培养的表皮细胞在病理学上被活化。(4)由于分散剂处理，胞外基质被分解。(5)因此移植了该细胞片的患处易受感染。除上述的现有技术的缺点之外，作为本专利技术对象的角膜上皮细胞、角膜内皮细胞、以及结膜上皮细胞等前眼部相关细胞，还具有如下缺点前眼部相关细胞由于细胞和细胞间的结合不如皮肤细胞强，因此即使使用上述分散剂，培养后也无法作为整个细胞片进行剥离、回收。为了解决上述问题，最近提出，在除去了海绵层和上皮层的羊膜上培养角膜上皮细胞或结膜上皮细胞、并使之组织化，并连同该羊膜一起作为移植用细胞片的技术(日本专利特开2001-161353号)。由于羊膜具有充分的膜强度，并且不具有抗原性，因此作为移植用细胞片的支持体相当合适，但是羊膜这种东西原先并不在眼睛内，为了更精密地构筑眼内组织，还是希望制造仅用眼内的细胞就具有充分强度的细胞片，该细胞片与角膜实质组织直接接触。另外，在日本专利特愿2001-226141号中，在细胞培养支持体上培养前眼部相关细胞，该细胞培养支持体是将相对于水的上限或下限临界溶解温度为0～80℃的温度响应性聚合物覆盖在基材表面上而成的，根据需要按照常规方法将培养细胞层多层化，通过只改变支持体的温度来剥离所培养的细胞片，制造具有充分强度的细胞片成为可能。另外，在该细胞片上还保持有基底膜类蛋白质，与上述用分散剂处理的细胞片相比，对组织的成活性也得到明显改善。但是，考虑到实际减轻患者的负担，希望能够进一步改善该成活性。另外，最近在医疗现场也有多种方法被提案。例如，WO98/31316中提出，为了治疗近视进行PRK法、LASIK法时，利用培养的角膜上皮细胞片的技术。但是，这里的培养角膜上皮细胞片是由上述分散剂剥离的细胞片，存在这样的问题，即，培养角膜上皮细胞片对激光削薄的角膜组织的附着性差，无法取得显著的治疗效果。另外，2001年5月10目的每日新闻纪事中，对角膜疾病的患者提出代替角膜粘贴培养口腔粘膜，促使患者角膜再生的技术。但是，这里的培养口腔粘膜是由上述分散剂剥离的粘膜，存在这样的问题，即，培养口腔粘膜对患者的角膜组织的附着性差，无法取得显著的治疗效果。本专利技术以解决上述现有技术的问题为目标。即，本专利技术的目的在于提供对前眼部组织的附着性良好的用于形成角膜上皮的细胞片。另外，本专利技术的目的在于提供其制造方法以及使用方法。
技术实现思路
本专利技术人们为了解决上述课题，从各种角度加以探讨，进行了研究开发。其结果发现，在用温度响应性聚合物覆盖基材表面的特定条件的细胞培养支持体上，在特定条件下培养用于形成角膜上皮的细胞，之后，使培养液温度在上限临界溶解温度以上或下限临界溶解温度以下，将所培养的用于形成角膜上皮的细胞片附着在特定的载体上，通过一边抑制细胞片的收缩，一边将其连同载体一起进行剥离，可以得到对活体组织附着性非常优良的用于形成角膜上皮的细胞片。本专利技术基于上述认识得以完成。即本专利技术提供了对前眼部组织的附着性良好的、紧密贴合在载体上的用于形成角膜上皮的细胞片。另外，本专利技术提供了对活体组织的附着性非常良好的用于形成角膜上皮的细胞片的制造方法，其特征为，在用0～80℃的温度范围内水合力变化的温度响应性聚合物覆盖基材表面而成的细胞培养支持体上培养用于形成角膜上皮的细胞，根据需要按照常规方法使培养细胞层多层化，之后，(1)使培养液温度在上限临界溶解温度以上或下限临界溶解温度以下，(2)将所培养的用于形成角膜上皮的细胞紧密贴合在载体上，(3)将其连同载体一起剥离。本专利技术还提供用于治疗损伤和/或创伤达到深部的组织的、对活体组织的附着性非常良好的用于形成角膜上皮的细胞片。本专利技术还进一步提供治疗方法，其特征为，对损伤和/或创伤达到深部的组织，移植对活体组织的附着性非常良好的用于形成角膜上皮的细胞片。本专利技术进一步提供不仅是医疗领域，作为用于评价化学物质、毒物或药品的安全性的细胞有用的用于形成角膜上皮的细胞片。具体实施例方式如上所述，本专利技术提供紧密贴合在载体上的用于形成角膜上皮的细胞片。在本专利技术中，称为“用于形成角膜上皮的细胞片”时，包含了由角膜上皮细胞形成的再生角膜上皮细胞片，或由角膜上皮细胞以外的细胞形成的角膜上皮代替细胞片。作为本专利技术的用于形成角膜上皮的细胞片使用再生角膜上皮细胞片时，适合使用的细胞可以列举角膜上皮细胞及其干细胞，但其种类不受任何制约。另外，作为本专利技术的用于形成角膜上皮的细胞片使用角膜上皮代替细胞片时，适合使用的细胞可以列举例如存在于颊膜、牙龈上的口腔粘膜细胞、毛根细胞、结膜上皮细胞中的任意一种或两种以上的混合物，或者它们与角膜上皮细胞的混合物，但其种类不受任何制约。制造这些的细胞片等时，不必在角膜上皮代替细胞的培养中添加特别的添加物，例如将口腔粘膜细胞作为角膜上皮代替细胞使用时，可以使用口腔粘膜细胞的标准的细胞培养方法进行培养，制造细胞培养片等。本专利技术的前后内容中，用于形本文档来自技高网...

【技术保护点】
用于形成角膜上皮的细胞片，其紧密贴合在载体上。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：冈野光夫，西田幸二，大和雅之，
申请(专利权)人：赛尔斯德株式会社，西田幸二，
类型：发明
国别省市：JP[日本]