【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物技术和基因治疗领域，尤其涉及应用于基因治疗的重组腺相关病毒(raav)载体的分离纯化方法。
技术介绍
1、腺相关病毒(adeno-associated virus,aav)属于细小病毒科，是一种单链dna病毒，其基因组大小为4700bp，基因组主要包含编码rep和cap的两个阅读框，阅读框两侧为带有回文序列的反向末端重复序列(inverted terminal repeat，itr)。研究发现aav有多种血清型，不同血清型的组织嗜性有很大差别，例如aav8具有较强的肝嗜性，aav9可以穿越血脑屏障具有较好的中枢神经系统嗜性。目前对于腺相关病毒(aav)衣壳蛋白改造的研究越来越多，改造方法包括利用dna改组(dna shuffling)或易错pcr的方法，以获得功能优化的新型aav病毒载体的衣壳蛋白。其中aavx即是利用dna shuffling技术获得的新型aav载体(xiao xiao等，us9186419b2)，研究表明aavx对于肝脏靶向具有很高的转导效率(参见，例如wo2022/100748a1)。通过aav病毒载体将治疗性基因片段运送到特定的组织器官，可以有效治疗一些单基因遗传病或病毒感染类疾病，是目前最有前景的基因治疗载体。
2、用于生产raav载体的许多方法是本领域已知的，包括转染、稳定细胞株生产和感染性病毒生产系统，其中常用的是三质粒包装系统(xiao et al.,production of high-titer recombinant adeno-associated virus
3、目前，超速离心、亲和层析、离子交换层析、混合色谱层析、分子筛层析等多种纯化手段被应用到aav载体纯化(曲伟红，2015，中国药房，26(34)：4880-4883)。在早期阶段，以peg沉淀和超速离心为主体的纯化路线被应用于aav纯化。虽然该方法适用于多种血清型，在空壳去除方面有优势，但其也有明显不足：一方面是超速离心处理量小，单次离心耗时较长，不适合大规模纯化；另一方面氯化铯是重金属，以氯化铯为超离介质时，样品安全性方面有较大风险(benjamin strobel等，2015，hum gene ther methods，26(4)：147-157；曲伟红，2015，中国药房，26(34)：4880-4883)。
4、随着aav相关基因治疗产品剂量不断提高，规模化生产对于aav下游纯化工艺越来越重要，各种色谱柱层析显示出其独有优势，例如亲和层析和离子交换层析等(benjaminadams等，2020，biotechnol bioeng，117(10)：3199-3211；曲伟红，2015，中国药房，26(34)：4880-4883；weihong qu等，2015，curr pharm biotechnol，16(8)：684-695等)。
5、有研究提到一次或多次离子交换层析(iex)结合超速离心(uc)纯化路线(例如，wo2019/094253a1；cn102947453a3等)，但该路线由于使用了超速离心，导致其成本过高，且无法应用于工业生产的大规模纯化中。现有文献中提到离子交换和分子筛层析的纯化路线，然而，该路线分离aav特异性较差，对等电点和分子量与aav相近的残留蛋白很难去除(marc-andrérobert等，2017，biotechnol j，12(3)：1600193，1-16)。
6、随着基因治疗领域的不断发展，临床级别的aav产品对纯度、活性、残留宿主细胞蛋白、残留宿主细胞dna等质量指标的要求不断提高，如何合理地利用不同的纯化手段形成一套纯化工艺，得到临床级别的aav是一个重大挑战，现有文献和专利上的工艺路线大多是实验室级别样品制备，很少能满足临床级别aav质量的需求；另一方面，aav相关基因治疗产品的剂量要求也越来越高，纯化工艺易于放大则显得尤其重要，而以超速离心为主的纯化工艺在放大过程中有诸多限制。
7、另外，现有技术中的纯化方法大多数是基于aav8、aav9等腺相关病毒载体，而对于基于aavx的重组病毒载体的纯化方法鲜有相关报道。而且现有技术中的纯化方法大部分是针对传统的以腺病毒为辅助病毒生产出的raav样品，而对于纯化难度相对较大的由杆状病毒包装系统生产出的raav样品的纯化则少有报道。
8、基于以上问题，满足临床级aav产品，特别是aavx产品的质量要求，又兼顾可放大性的规模化纯化工艺仍然存在极大需求。
技术实现思路
1、基于此，本专利技术提供了一种重组腺相关病毒载体的纯化方法，其所纯化出的raav样品具有很高的回收率、纯度和活性，各种杂质(包括，残留宿主细胞蛋白、残留宿主细胞dna等)相关的质量指标也比较优异。同时，该纯化方法成本低，易于大规模纯化，是工业生产中其他纯化方法所不具备的优势。
2、本专利技术提供一种重组腺相关病毒(raav)载体的纯化方法，其特征在于，所述方法依次包括如下步骤：
3、(1)获得待纯化的含有raav载体的样品；
4、(2)对样品进行亲和层析或阳离子交换层析，收获洗脱液；
5、(3)对上述洗脱液进行磷灰石层析纯化；
6、(4)对步骤(3)中纯化后的样品进行分子筛层析或超滤；
7、(5)随后，对样品进行阴离子交换层析，收获洗脱液；
8、(6)对上述洗脱液再次进行分子筛层析或超滤。
9、重组腺相关病毒(raav)载体
10、在某些具体实施方案中，所述raav载体具有包含来源于aav进化支a-f中的任意一种衣壳蛋白或其杂交/嵌合型，包括但不限于aav1、aav2、aav3、aav3a、aav3b、aav4、aav5、aav6、aav7、aav8、aav9、aav10、aav11、aav12、aav2.5、aav-dj、aav-dj/8、aavhu.32、aavhu.68、aavrh8、aavrh10、aavrh74、aav-php.b、aav-php.eb、aav-php.s或aavx的衣壳蛋白或其变体中的任意一种。在优选实施方案中，所述raav具有包含来源于aavx的衣壳蛋白。在一些具体实施方式中，所述aavx衣壳蛋白的氨基酸序列如s本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种纯化重组腺相关病毒(rAAV)载体的方法，其特征在于，所述方法依次包括如下步骤：
2.权利要求1所述的方法，其特征在于，所述rAAV载体具有包含来源于AAV进化支A-F中的任意一种衣壳蛋白或其杂交/嵌合型，包括但不限于AAV1、AAV2、AAV3、AAV3A、AAV3B、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV2.5、AAV-DJ、AAV-DJ/8、AAVhu.32、AAVhu.68、AAVrh8、AAVrh10、AAVrh74、AAV-PHP.B、AAV-PHP.eB、AAV-PHP.S或AAVX的衣壳蛋白或其变体中的任意一种，优选AAVX。
3.权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述rAAV载体由常规的AAV载体包装系统制备而获得，所述AAV载体包装系统包括但不限于两质粒包装系统、三质粒包装系统、杆状病毒包装系统和以Ad或HSV为辅助病毒的AAV包装系统，优选三质粒包装系统和杆状病毒包装系统。
4.权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于，所述亲和层析为肝素亲和层
5.权利要求4所述的方法，其特征在于，所述亲和层析包括平衡、上样、洗脱等步骤，以及可选择地，还包括洗杂步骤，其中，
6.权利要求1-5中任一项所述的方法，其特征在于，所述阳离子交换层析填料为POROS50HE、POROSHS、Bio-RAD Nuvia HR S、SP HP、Capto S中的一种。
7.权利要求6所述的方法，其特征在于，所述阳离子交换层析包括平衡、上样、洗脱等步骤，其中，上样前将样品的电导调整为5.5±1ms/cm-10.5±1ms/cm，优选5.5±1ms/cm-7.5±1ms/cm；将样品的pH范围调整为4.5-9.5，优选6.0-7.5，更优选为6.5；
8.权利要求1-7中任一项所述的方法，其特征在于，所述磷灰石层析为CHT层析或CFT层析。
9.权利要求8所述的方法，其特征在于，所述磷灰石层析包括平衡、上样、洗脱等步骤，其中，上样前将样品的电导调整为5±1ms/cm-12±1ms/cm，优选5±1ms/cm-9±1ms/cm；
10.权利要求1-9中任一项所述的方法，其特征在于，所述步骤(4)中采用的分子筛为G25层析，包括平衡、上样和洗脱步骤；超滤采用的是TFF超滤，包括浓缩和洗滤步骤。
11.权利要求10所述的方法，其特征在于，所述TFF超滤所用介质为中空纤维，其孔径大小为100kD。
12.权利要求10或11所述的方法，其特征在于，在步骤(4)中，
13.权利要求1-12任一项所述的方法，其特征在于，所述阴离子交换层析种类包括但不限于Poros HQ、Poros PI、HiTrap Q、UnoQ、Mono Q HR、DEAE Macroprep、Q-sepharose、CIM-QA monolithic disk、Source 15Q、Q HP，优选地，所述阴离子交换层析为Q HP层析。
14.权利要求13所述的方法，其特征在于，所述阴离子层析包括平衡、上样、洗脱等步骤，以及可选择地，还包括洗杂步骤，其中，
15.权利要求1-14任一项所述的方法，其特征在于，所述步骤(6)中采用的分子筛为S200层析，包括平衡、上样和洗脱步骤；超滤采用的是TFF超滤，包括洗滤步骤。
16.权利要求15所述的方法，其特征在于，所述TFF超滤所用介质为传统膜包或中空纤维，其中中空纤维孔径大小为100kD。
17.权利要求15或16所述的方法，其特征在于，在步骤(6)中，
18.权利要求1-17任一项所述的方法，其特征在于，在进行步骤(2)的亲和层析之前还包括对样品进行病毒灭活的步骤。
19.权利要求18所述的方法，其特征在于，所述病毒灭活采用S/D灭活法，灭活剂为聚山梨酯80和磷酸三丁酯，或Triton-100和磷酸三丁酯；灭活的温度为2-39℃，优选22-25℃；所述S/D灭活的时间为1h-6h，优选3h-4h。
20.权利要求1-19中任一项所述的方法，其特征在于，对步骤(2)中获得的洗脱液进行核酸酶处理，之后再进行步骤(3)的磷灰石层析。
21.权利要求20所述的方法，其特征在于，所述核酸酶处理为向洗脱液中加入核酸酶和镁离子，所述核酸酶的浓度为15U/ml-150U/ml，优选20-90U/ml；所述镁离子的浓度为1mM-12mM，优选1-10mM；所述核酸酶消化的温度为2-39℃，优选2-8℃；所述核酸酶处理的时间为0...
【技术特征摘要】
1.一种纯化重组腺相关病毒(raav)载体的方法，其特征在于，所述方法依次包括如下步骤：
2.权利要求1所述的方法，其特征在于，所述raav载体具有包含来源于aav进化支a-f中的任意一种衣壳蛋白或其杂交/嵌合型，包括但不限于aav1、aav2、aav3、aav3a、aav3b、aav4、aav5、aav6、aav7、aav8、aav9、aav10、aav11、aav12、aav2.5、aav-dj、aav-dj/8、aavhu.32、aavhu.68、aavrh8、aavrh10、aavrh74、aav-php.b、aav-php.eb、aav-php.s或aavx的衣壳蛋白或其变体中的任意一种，优选aavx。
3.权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述raav载体由常规的aav载体包装系统制备而获得，所述aav载体包装系统包括但不限于两质粒包装系统、三质粒包装系统、杆状病毒包装系统和以ad或hsv为辅助病毒的aav包装系统，优选三质粒包装系统和杆状病毒包装系统。
4.权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于，所述亲和层析为肝素亲和层析。
5.权利要求4所述的方法，其特征在于，所述亲和层析包括平衡、上样、洗脱等步骤，以及可选择地，还包括洗杂步骤，其中，
6.权利要求1-5中任一项所述的方法，其特征在于，所述阳离子交换层析填料为poros50he、poroshs、bio-rad nuvia hr s、sp hp、capto s中的一种。
7.权利要求6所述的方法，其特征在于，所述阳离子交换层析包括平衡、上样、洗脱等步骤，其中，上样前将样品的电导调整为5.5±1ms/cm-10.5±1ms/cm，优选5.5±1ms/cm-7.5±1ms/cm；将样品的ph范围调整为4.5-9.5，优选6.0-7.5，更优选为6.5；
8.权利要求1-7中任一项所述的方法，其特征在于，所述磷灰石层析为cht层析或cft层析。
9.权利要求8所述的方法，其特征在于，所述磷灰石层析包括平衡、上样、洗脱等步骤，其中，上样前将样品的电导调整为5±1ms/cm-12±1ms/cm，优选5±1ms/cm-9±1ms/cm；
10.权利要求1-9中任一项所述的方法，其特征在于，所述步骤(4)中采用的分...
【专利技术属性】
技术研发人员：施俊伟，张子辉，柯辰，王宏伟，
申请(专利权)人：北京三诺佳邑生物技术有限责任公司，
类型：发明
国别省市：
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