将外源蛋白递送到胞质溶胶中的方法,及其用途技术

本发明专利技术涉及一种用于将外源蛋白递送到胞质溶胶中的方法，包括将靶抗原（如一种蛋白）结合于包含二分蛋白外毒素的片段的转运因子，但不是相应的保护性抗原。优选将所述靶蛋白融合于所述转运因子。优选的转运因子包括来自炭疽芽孢杆菌的致死因子（ＬＦｎ）的保护性抗原结合结构域，它包括１－２５５号氨基酸，优选与ＬＦｎ具有至少８０％同源性的至少８０个氨基酸的片段，以及来自羧基部分的不结合ＰＡ的大约１０５个氨基酸的片段。所述靶抗原可以包括希望诱导ＣＭＩ反应的任何分子，包括病毒抗原和肿瘤抗原。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
,及其用途的制作方法
本申请涉及，新融合蛋白及其用途。
技术介绍
很多注意力都集中在产生免疫反应方面。对外源抗原的一种类型的免疫反应是产生抗体，通常称之为体液免疫。第二种形式的免疫反应是通过抗原呈递细胞(APC)呈递抗原产生的。这种类型的免疫反应被广义地称为细胞介导的免疫反应(CMI)，或T细胞反应。尽管这两种类型的免疫反应都是重要的，最近将主要注意力集中在CMI上。在处理诸如由人类免疫缺陷病毒(HIV)导致的AIDS的感染性疾病时，未能证实针对所述病毒及其部分的抗体反应足以产生免疫性。类似地，在处理与很多恶性肿瘤相关的外源蛋白时，也未能证实所述抗体反应是足够的。因此，将注意力集中在产生CMI反应方面。为了诱导CMI，必须将一种抗原结合在APC表面上的主要组织相容性复合体(MHC)I类或II类分子上。I类分子通常将抗原，如内源蛋白，所述蛋白来自病毒感染，以及肿瘤抗原呈递到外面。当由宿主I类MHC编码的分子呈递病原体来源的(或癌)肽表位(通常8-10个氨基酸)时，抗原特异性T细胞通常能识别受感染的靶细胞(7)。所述表位源于被蛋白体裂解成小的肽片段的细胞质蛋白。这些片段随后被转运到内质网(ER)腔中，在这里它们与新合成的MHC-I分子复合，然后转运到细胞表面，在这里发生T细胞识别(8-13)。细胞外流体中的抗原(外源抗原)通常不能进入大多数细胞的这种加工区室。因此，用疫苗诱导CMI的一个主要挑战是，将外源抗原递送到胞质溶胶内，以便由MHC I类分子呈递。希望能够制备多种感染性疾病，如HIV，以及癌症，如前列腺癌，乳腺癌和黑素瘤的疫苗。例如，越来越多的证据表明CMI在控制HIV感染方面发挥重要作用(Ogg等，Science 2792103-6(1998)；Schmitz等，Science 283857-60(1999)；Brodie等，Nat.Med.534-41(1999))。接触过HIV但是仍然没有被感染的个体，通常具有抗病毒CMI，但是没有抗体反应。在形成特异性抗体之前，初次感染的病毒血症，是通过病毒特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)形成而解决的(Letvin，Science 2801875-96(1998))。以上数据表明了CMI在控制HIV感染方面发挥着关键作用。很多肿瘤与特定蛋白的表达和/或某些蛋白的过量表达相关。例如，前列腺癌与升高水平的蛋白，如前列腺特异性抗原(PSA)相关。乳腺癌可能与诸如Her-2，Muc-1，CEA之类的蛋白的表达和/或过量表达相关。因此，相当大的注意力集中在试图产生免疫反应方面，特别是在治疗所述恶性肿瘤时产生针对所述抗原的CMI。产生针对传染性疾病的细胞介导的免疫性的方法包括使用完整的感染剂，例如，通过制备遗传工程化的失活病毒或使用杀灭的感染剂。另一种方法是亚基疫苗，它能将一种或多种抗原(而不是完整病毒)呈递给受治对象。为了产生CMI，必须将抗原递送到细胞内部。所述细胞对外源蛋白的吸收很差。因此，优选方法是使用诸如病毒载体、脂质体、裸DNA的方法或类似方法。不过，所述方法具有诸多缺陷。例如，很多重组病毒在反复施用时，其本身会产生抗原性反应。由于产生免疫反应的标准形式通常需要被称为激发的起始注射，和被称为加强的后续注射，以便获得满意的免疫性，这可能是一个严重问题。另外，尽管大部分注意力一直集中在改善病毒载体的安全性方面，但是总是存在某些危险。例如，很多目标群体，如HIV感染的群体可能具有减弱的免疫系统。因此，在很多个体中是完全安全的某些病毒载体在上述个体内会产生某种程度的危险。将蛋白递送到细胞内的方法也未能证明像本专利技术这样完全安全。因此，需要新的和简单的方法将抗原递送到胞质溶胶内，以便刺激CMI。为了产生CMI反应，还存在难于测定所述反应的技术问题。用于检测细胞介导的免疫反应的现有实验室测定方法具有严重缺陷，特别是在应用于各种临床设置中的大规模疫苗效力试验时更是这样，这是因为使用现有技术测定CMI所需要的现有设备和技术支持，通常在需要它们的野外设施中是很少的。人们认为CTL在控制HIV-1感染方面起着关键作用，并且设计了多种HIV-1疫苗候选物，以便刺激T细胞反应，和中和抗体(1-6)。不过，用于检测CMI，如HIV-特异性CTL的标准实验室方法是复杂的、费时间的、并且通常局限于高度专业化的设备。用于检测T细胞反应的改进方法，将会对T细胞依赖性疫苗或免疫治疗的开发产生显著影响。这种策略有可能被应用于其他研究领域，其中，已知CMI反应在预防和控制疾病方面起着重要作用。体外检测CMI反应的一个困难是因为对抗原呈递的特殊需要。如上文所述，将外源蛋白递送到胞质溶胶内，以便通过MHC I类分子呈递给T细胞是一种重大挑战。所述I类途径的物理学分配一直是在体外检测T细胞反应的主要障碍。因此，大部分测定CMI的现有实验室方法，采用活病毒或细菌载体将抗原递送到胞质溶胶中，其中，诸如痘苗病毒的重组痘病毒是最常使用的。另一种方法是使用源于已知CTL表位的合成肽(10-20个氨基酸)从外部将MHC-I分子加载到靶细胞表面上。这种方法在一般临床应用中具有严格限制。诸如重组痘苗病毒的活病毒载体的使用，需要受过训练的和免疫过的实验室人员，包括最低污染设施，作为预防性安全措施。合成肽不仅价格十分昂贵，而且适合各种群体的多样性MHC-I分子的“通用”肽特征的设计也是极其困难的。因此，开发测定T细胞反应的测定方法的挑战是将外源抗原的大片段递送到胞质溶胶内，而又不依赖活的重组病毒或细菌载体。因此，需要能够用于体外检测CMI的试剂盒。特别是可方便地在诸如非洲、印度和亚洲的遥远地方使用的试剂盒，在这些地方，有很多建议要检测大量的疫苗候选物，如抗HIV的疫苗。现在，我们已经发现诸如炭疽芽孢杆菌的二分蛋白外毒素家族包含可用于将诸如蛋白的外源抗原递送到胞质溶胶中的片段。来自所述蛋白的一种优选的蛋白片段，是含有保护性抗原(PA)结合结构域的N-末端部分，而不是会产生对所述细胞的毒性的部分。更优选地，所述片段业已修饰过，以便除去结合PA的特定结构域。炭疽芽孢杆菌是动物和人类炭疽病的致病剂。由炭疽芽孢杆菌产生的毒素由两种二分蛋白外毒素，致死毒素(LT)和水肿毒素组成。LT由保护性抗原(PA)和致死因子(LF)组成，而水肿毒素由PA和水肿因子(EF)组成。三种成分PA，LF和EF中，没有一种单独是有毒性的。不过，一旦组合在一起，水肿毒素能导致水肿，而LT通过在动物和人体内的系统性休克能导致死亡。与它在形成两种毒素中的关键作用吻合，业已将PA确定为抗炭疽病疫苗的保护性成分。目前对炭疽毒素作用的分子机制的假设如下PA是具有735个氨基酸的多肽，它通过细胞受体与哺乳动物细胞表面结合。一旦结合之后，通过细胞蛋白酶将PA裂解成63-kDa的分子而被激活，它在靶细胞的细胞质膜中能形成环形七聚体(附图说明图1)(6，7)。所述PA七聚体然后与通过胞吞作用而内化的EF或LF结合。在内体酸化之后，PA使得EF或LF能进入胞质溶胶，推测是通过由所述七聚体的形成的一个孔进入的。在胞质溶胶中，EF起着腺苷酸环化酶的作用(8)，将ATP转化成cAMP。异常高水平的cAMP干扰了细胞代谢。LF在胞质溶胶中的作用是通过一种尚不十分了解的本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种将靶抗原递送到细胞的胞质溶胶中的方法，包括将所述靶抗原结合于一种转运因子，其中，所述转运因子包含对所述细胞没有毒性的二分蛋白外毒素的片段，并且，其中不使用保护性抗原（ＰＡ）。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：Y卢，H曹，
申请(专利权)人：哈佛大学校长及研究员协会，综合医院公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]