一组新的抗菌肽及其制备方法和应用技术

本发明专利技术提供一组新的抗菌肽，这些抗菌肽具有比天然抗菌肽更强的杀菌活性，对各种致病菌的杀灭效果都很好。本发明专利技术还公开了该组抗菌肽的制备方法，可以用固相化学法合成，也可以通过基因工程表达获得。本发明专利技术合成抗菌肽可以用于制备治疗革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、真菌或病毒感染引起的疾病的药物。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一组抗菌肽、其制备方法及在制备治疗细菌、真菌、病毒感染的药物中的应用。
技术介绍
抗菌肽是生物体经诱导产生的一种具有生物活性的小分子多肽，一般由20-60个氨基酸组成，分子量在2000-7000D左右。随着医学免疫学和分子生物学的迅速发展，抗菌肽的研究越来越成为生物技术与生物医药领域中的热门课题。至今为止，在许多动物(尤其是昆虫)、植物、微生物和人体上已发现了超过200多种抗菌肽，这类短肽不仅对细菌、真菌有广谱的杀菌作用，而且对病毒、原虫及癌细胞也有攻击作用。临床试验也表明，在机体感染病菌或可能导致病菌感染的情况下，抗菌肽能快速杀灭已侵入的病菌，并且能阻止病菌的继续侵染。随着对抗菌肽一级结构和高级结构研究的不断深入，已有许多研究者对这些抗菌肽的结构和功能进行研究，发现在模拟膜的疏水环境下，分子中的α-螺旋度与其杀菌活性密切相关。另外研究结果表明抗菌肽是通过破坏膜的完整性使得细菌细胞膜渗漏而杀死细菌(Nakajima Y.etal.，J.Biol.Chem，2621665-1669；Zasloff M.Nature，2002，415389-395)。因此有人试图通过增加分子中α-螺旋结构或提高多肽中含正电荷氨基酸的比例来寻找更强抗菌活性的多肽(Broth W.B.etal.，Antimicrobial Agents Chemotherapy，2001，451894-1895；HongS.Y.etal.，Peptides，2001，221669-1674)。美国专利6,316,594公开了天然抗菌肽parasinI，它是一种新的从鲶鱼中分离出来的，是由鲶鱼在表皮损伤时为防止微生物的入侵其上皮粘膜层产生出一种具有很强抗菌作用的多肽，属于α-螺旋抗菌肽，分子量为2000.4Da，由19个氨基酸残基组成，序列为Lys Gly Arg Gly Lys Gln Gly Gly Lys Val Arg Ala Lys Ala Lys Thr Arg Ser Ser。尽管专利文献中的Parasin I对微生物表现出非常有效的广谱抗菌活性，包括革兰阳性和革兰阴性细菌以及真菌，而且没有任何溶血性。它合成的衍生物也具有有效的活性。但是在我们实验中却发现其杀菌活性较低，天然序列很难应用于临床，但是Parasin I基本没有溶血性，它的一些相关的序列改造和功能应用方面的开发还进行的较少。所以本专利技术想通过对Parasin I序列的改造，得到杀菌活性更强的有药用开发价值的抗菌肽，即可以形成新的专利技术。
技术实现思路
本专利技术需要解决的技术问题之一是提供一组抗菌肽。本专利技术需要解决的技术问题之二是提供一组抗菌肽的制备方法。本专利技术需要解决的技术问题之三是公开所述抗菌肽的应用。本专利技术的专利技术构思是这样的我们在经过多次试验后发现在Parasin I序列中间隔插入疏水性氨基酸和带正电荷的氨基酸后，形成两个疏水氨基酸和两个正电荷氨基酸交替排布的序列，这样的结构减低毒性并提高杀菌活性。经过改造后筛选到以下12条序列，抑杀菌试验证明其杀菌活性有较大的提高。而溶血毒性基本没有变化，非常有希望用于治疗细菌感染的新药的开发。本专利技术提供的抗菌肽是在对天然抗菌肽的序列、结构分析的基础上设计合成的，它们的这一系列序列被命名为GKV，序列如下GK V-1Lys Gly Ala Arg Lys Gly Ala Lys Arg Gln Gly Gly Lys Lys Val Ala Arg Lys Ala Leu Lys ArgAla Gly LysGKV-2Lys Gly Gly Arg Lys Gly Ala Lys Arg Gln Gly Gly Lys Lys Leu Ala Arg Lys Ala Leu LysArg Ala Gly ArgGKV-3Lys Gly Gly Arg Lys Gly Ala Lys Arg Gln Gly Gly Lys Lys Leu Ala Arg Lys Ala Leu LysGKV-4Lys Gly Val Arg Lys Gly Ala Lys Arg Gln Gly Cys Lys Lys Leu Ala Arg Lys Ala Leu LysGKV-5Lys Gly Ala Arg Arg Gly Ala Lys Arg Gly Gly Lys Lys Leu Ala Arg Lys Ala Leu LysGKV-6Lys Gly Ala Arg Arg Leu Ala Lys Arg Ser Gly Lys Lys Val Ala Arg Lys Ala Gly ArgGKV-7Lys Phe Ala Arg Arg Leu Ala Lys Arg Leu Gly Lys Lys Val Ala Arg Lys Leu Gly ArgGKV-8Lys Phe Leu Arg Arg Leu Ile Lys Arg Leu Val Lys Lys Val Leu Arg Lys Leu Gly ArgGKV-9Lys Ala Ala Lys Lys Ala Ala Lys Arg Ala Ala Lys Lys Ala Thr ArgGKV-10Lys Ala Leu Lys Lys Ala Leu Lys Arg Ala Leu Lys Lys Ala Leu ArgGKV-11Lys Gly Leu Lys Lys Gly Leu Lys Arg Gly Leu Lys Lys Gly Leu ArgGKV-12Lys Ala Thr Lys Lys Ala Leu Lys Arg Ala Gly Lys Lys Ala Thr Arg本专利技术提供的一组抗菌肽，其制备方法可以是固相化学法，也可以将抗菌肽的编码基因克隆到载体上，然后在宿主细胞中表达后获得。其中表达载体可以是质粒或病毒中的一种，宿主细胞可以是原核细胞，包括大肠杆菌、枯草芽孢杆菌等，宿主细胞也可以是真核细胞、包括酵母细胞、植物细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞等。制备的抗菌肽可通过质谱鉴定。为了深入研究本专利技术这类生物学活性抗菌肽的结构与功能关系，利用美国应用系统生物公司生产的Pioneer多肽合成仪制备本专利技术公开的一组抗菌肽和作为对照的抗菌肽，以进行研究。利用96孔板法检测多肽的杀菌活性(In Yup Park etc；FEBS Letters；437(1998)258-262)以预先合成的天然抗菌肽GramicidinS，parasinI，magaininII为对照，进行杀菌活性检测。结果表明本专利技术抗菌肽的杀菌活性强于所述三种天然抗菌肽的杀菌活性。抗菌肽在高效杀菌的同时也有可能作用于高等有机体包括人体细胞，因为抗菌肽的作用方式都是在细胞膜上穿孔使得细胞发生渗漏死亡。所以把抗菌肽能否使红细胞发生渗漏作为其是否有毒性的一个标准，如果抗菌肽能使红细胞中的血红蛋白发生渗漏，就可以通过检测OD490值确定毒性的大小。因此本专利技术还检测了抗菌肽对人体红细胞的溶血活性，实验表明，抗菌肽溶血率值很低，证实本专利技术抗菌肽的溶血毒性极小。此外，又对本专利技术抗菌肽进行动物体内急性毒性试验，证明抗菌肽无毒性作用。又进行抗菌肽对小白鼠急性感染金黄色葡萄球菌的抑制作本文档来自技高网...

【技术保护点】
一组抗菌肽，其特征在于所述抗菌肽具有序列表中所列的氨基酸序列。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：黄青山，李国栋，
申请(专利权)人：上海高科联合生物技术研发有限公司，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]