本发明专利技术一般涉及一种新的胰凝乳蛋白酶，其对植物的丝氨酸蛋白酶抑制剂展示抗性。更具体地，本发明专利技术提供了一种胰凝乳蛋白酶，当进食花烟草（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ａｌａｔａ）的丝氨酸蛋白酶抑制剂时，其在棉铃虫和澳洲棉铃虫昆虫幼虫肠道中被上调。因此，该新胰凝乳蛋白酶代表了拮抗剂鉴别的靶，所述拮抗剂包括被提议可有效地用于对照棉铃虫的种的抑制剂，所述棉铃虫种群形成了植物中产生的丝氨酸蛋白酶抑制剂抗性。所述胰凝乳蛋白酶拮抗物可以局部应用到植物，或者，当处于蛋白质形式时，可以在植物细胞中以遗传方式产生。所述拮抗物可以在基因表达或蛋白质活性水平上发挥作用。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
技术介绍
专利
本专利技术通常涉及一种新的胰凝乳蛋白酶，其对植物的丝氨酸蛋白酶抑制剂展示抗性。更具体地，本专利技术提供了一种胰凝乳蛋白酶，当进食花烟草(Nicotiana alata)丝氨酸蛋白酶抑制剂时，其在棉铃虫(Helicoverpa armigera)和澳洲棉铃虫(Helicoverpapunctigera)昆虫幼虫的肠道中被上调。因此，该新胰凝乳蛋白酶代表了用于识别拮抗物的靶，所述拮抗剂包括被提议可有效地用于对照棉铃虫的种(Helicoverpa spp.)群体的抑制剂，该群体已形成了对在植物中产生的丝氨酸蛋白酶抑制剂的抗性。胰凝乳蛋白酶的拮抗物可以局部应用到植物，或者，当处于蛋白质的形式时，可以在植物细胞中通过遗传的手段产生。拮抗物可以在基因表达或蛋白质活性的水平上发挥作用。现有技术的描述也将在本说明书中提到的出版物的文献细节收集在说明书最后。在本说明书中，对任何现有技术的参考不是而且也不应该被视为承认或任何形式的暗示该现有技术构成了任何国家的公知常识的一部分。观赏性烟草，花烟草，的雌性生殖组织和受损叶片积聚了大量的丝氨酸蛋白酶抑制剂(PI)，用于预防害虫和病原体(Atkinson等，植物细胞5203-213，1993)。这些6kDa的PI积聚在液泡中(Miller等，植物细胞111499-1508，1999)，并源于体内40.3kDa前体蛋白质的翻译后修饰。PI蛋白质的前体(称为“NaPI”)由高序列同一性的6个重复区域组成(附图说明图1)，每一个都具有潜在的PI反应位点。对该6个重复的前体蛋白质的加工出乎意料地发生在重复区域内而不是重复区域之间的位点。完全去除包含在每一重复区域内的连接体序列(Glu-Glu-Lys-Lys-Asn)产生了5个邻近的6kDa抑制剂(C1和T1-T4)以及一个新的双链胰凝乳蛋白酶抑制剂(C2)，其由N端和C端肽片段的二硫键连接形成(Heath等，EuropeanJournal of Biochemistry 230(1)25-257，1995；Lee等，NatureStructural Biology 6(6)526-530，1999)。已采用1H-NMR技术研究了C1、T1-T4和C2的结构(Nielson等，J.Mol.Biol.242231-243，1994；Nielson等，Biochemistry 3414304--14311，1995；Lee等，1999，出处同前)。花烟草也具有与NaPI相关的第二基因，其编码了密切相关的前体蛋白质，具有4个而不是6个重复域(Miller等Plant Mol.Biol.42329-333，2000)。该前体也在体内被加工，导致释放3个邻近的6kDa抑制剂(C1、T4和T5)和双链抑制剂C2(图1)。三个抑制剂(C1、C2和T4)与从6个域的前体释放的那些相同。已经为其它茄科植物包括烟草(N.tabacum)(Balandin等，Plant Mol.Biol.271197-1204，1995)、N.glutinosa(Choi等，Biochim.etBiophys.Acta 1492211-215，2000)、L.esculentum(Taylor等，Plant Mol.Biol.231005-1014，1993)和Capsicum annum(Moura和Ryan，Plant Physiol.126289-298，2001；Antcheva等，Protein Sci.102280-2290，2001)描述了相关的多域前体。几个研究组已经报道了丝氨酸蛋白酶抑制剂对昆虫消化蛋白酶活性的影响并暗示出它们由植物产生，用于预防昆虫害虫和微生物的破坏性作用(Ryan，Annu.Rev.Phytopathol.28425-449，1990；Gatehouse等，用于农作物保护的植物基因操作，农业生物技术，No.7，Eds.Gatehouse，Hilder & Boulter，International U.K.，pp.155-181，1992)。专门进食一种特定宿主植物的昆虫通常对该植物产生的丝氨酸PI具有抵抗力，但对非宿主产生的PI敏感(Broadway和Villani，Entomol.Expo.Appl.76303-312，1995；Broadway，J.Insect.Physiol.41107-116，1995)。因此，有兴趣将编码丝氨酸P I的基因从非宿主移入农作物以增强抗虫性，并降低对化学杀虫剂的依赖性。近来，然而，几个研究组已报道了摄食大量PI后，某些昆虫具有可改变蛋白水解酶在其中肠内的相对比例的能力(Broadway，1995，出处同前；Jongsma等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92(17)8041-8045，1995a)。例如，Broadway(1995，出处同前)发现某些鳞翅目昆虫可产生两类主要的胰蛋白酶样蛋白酶，其一对来自甘蓝叶的PI不敏感。摄食甘蓝PI后，昆虫增加了不受PIs影响的那类胰蛋白酶的生产，并因此能够不受阻碍地生长和发育。Jongsma及其合作者(1995，出处同前)采用进食来自马铃薯(PotII)和烟草的PI的甜菜夜蛾(Spodoptera exigua)幼虫进行了类似观察。在这些条件下，调节这些蛋白酶分泌的因素是未知的。这些研究显示，对于长期的植物保护，专用于昆虫肠道中的一种或两种蛋白酶的PI将具有有限的用途。在转基因植物中，编码花烟草PI的基因比其它植物的PI对于增强抗虫性具有潜在的优势。大多数植物丝氨酸PI仅含有一个或两个抑制域，而花烟草PI前体具有4个或六个(图1)。因此，有潜能设计花烟草PI的各个域以提供对抗昆虫肠道中的几种蛋白酶的抑制活性。已经部分表征了几种鳞翅目(Lepidoptera)、鞘翅目(Coleoptera)和直翅目(Orthoptera)的中肠蛋白酶。在大多数鳞翅目物种中，内蛋白酶活性主要是由于丝氨酸蛋白酶(胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和/或弹性蛋白酶)，并且半胱氨酸和金属蛋白酶是不可检测的(Christeller等，Insect Biochem.Molecul.Biol.22_735-746，1992；Terra和Ferreira，Comp.Biochem.Physiol.1091-62，1994；Xu和Qin，J.Econ.Entomol.87334-338，1994；Lee和Anstee，Insect.Biochem.Molec.Biol.2563-71，1995a；Johnston等，Insect Biochem.21389-397，1991；Johnston等，Insect Biochem.Molec.Biol.25(3)375-383，1995)。也已经识别了外肽酶和亮氨酸氨肽酶(Christeller等，1992，出处同前；Lee和Anstee，Insect.Biochem.Molec.Biol.25(1)49-61，1995b)。仅部分理解PI对昆虫的作用机理。描述了3种反应(i)严重延缓了生长，但肠道蛋白水解活性不减弱。Broadway和Duffey(J.InsectPhysiol.32673-680，198本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种分离的核酸分子，包含一种核苷酸序列，其编码来自棉铃虫的种的胰凝乳蛋白酶，或所述胰凝乳蛋白酶的变体、衍生物、同系物或类似物，其中，所述胰凝乳蛋白酶对来自花烟草的蛋白酶抑制剂（ＰＩ）展示抗性。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...
【专利技术属性】
技术研发人员：KM当斯，RL希斯，MA安德森，
申请(专利权)人：赫希玛有限公司，拉特罗布大学，
类型：发明
国别省市：AU[澳大利亚]
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