来自丝光绿蝇的胰凝乳蛋白酶及其在治疗伤口中的用途制造技术

本文描述了幼虫酶，特别是胰凝乳蛋白酶的用途。这些酶可用于治疗伤口，以进行清创和细胞再生。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】本专利技术涉及一种幼虫酶。更具体地说，本专利技术涉及一种或多种可从丝光绿蝇(Lucilia sericata)获得的幼虫酶，所述酶可用于组织再生与伤口愈合。幼虫侵扰对某些伤口的有益效果已在很多年前就被观察到了。然而，直到对于感染的抗生素抗性菌株的流行成为医学尤其是伤口愈合领域中的问题之前，对该过程涉及的机理并没有进行进一步的研究。之前的研究已经看到幼虫酶作为传统抗生素的添加剂或辅佐剂(adjuvants)在创口清创中(从伤口去除坏死的、感染的或外来的物质)，在控制感染中(防止或治疗感染)以及最近的在促进组织再生从而使伤口处的新组织生长并闭合伤口(愈合)中的作用。所使用的幼虫酶可以通过清洗幼虫，去除幼虫体表的任何排泄或分泌产物，从整个幼虫的血淋巴或均浆中获得，这之前进行或不进行幼虫的清洗。之前的研究还调查了在无菌或非无菌状态下培养幼虫的效果，使用均浆、血淋巴或排泄/分泌物的效果，以及幼虫年龄的效果(新孵化或一龄或二龄)。发现所有这些因素都能影响获取自幼虫的产品的性质或活性。本专利技术的专利技术者最近关注于幼虫产物，特别是为幼虫产物组成部分的酶的伤口愈合特性，所述酶通过促进组织生长而促进伤口闭合。令人惊讶的是，本专利技术的专利技术者已经发现，在丝光绿蝇幼虫的排泄/分泌物(表面清洗物)中发现的一种或多种胰凝乳蛋白酶在组织形成中起关键作用：这样的酶经常与组织破裂(breakdown)相联系。相应地，本专利技术提供一种源于昆虫幼虫的分离的胰凝乳蛋白酶或其类似物或其合成形式。有利地，本专利技术的胰凝乳蛋白酶已经表现为发挥双重且矛盾的性质，其不光在伤口清创中(去除坏死的、感染的或外来的物质)有作用，这是蛋白酶意料之中的性质；还在成纤维细胞粘连(adhesion)(即组织生长)中有作用，这是蛋白酶完全出乎意料的性质。本专利技术的胰凝乳蛋白酶具有选择性活性；其去除或降解某些组织，例如伤口焦痂，但并不去除或降解所有组织，例如健康的或新的组织。有理由预料这种或每种蛋白酶将降解或去除组织而不管其类型，例如发生于由铜绿-->蝇引起的丽蝇皮肤蝇蛆病的情况，其中坏死的和健康的组织被降解。同一种酶的清创和促进细胞生长的双重特性是不常见的而且对于本领域技术人员而言是惊人的，因为这些特性理应是相互矛盾的。本文使用的术语“焦痂”意在定义任何死亡的组织，其从皮肤的表面脱落，包括在烧伤、坏疽、溃疡(尤其是压力性溃疡)、感染(尤其是真菌感染)、晚期暴露于炭疽或任何坏死的组织之后。昆虫优选的是丝光绿蝇(Lucilia sericata)。本专利技术的胰凝乳蛋白酶优选地获取于或可获取于昆虫幼虫的排泄/分泌物。然而，相同的成分可能会存在于血淋巴或均浆中，并可以从这些来源中获取。胰凝乳蛋白酶可以例如通过清洗幼虫并收集清洗介质来获得。本专利技术的专利技术者已经在之前发现昆虫幼虫的排泄/分泌物(ES)含有组成型表达的和可诱导的成分，包括酶、激素等。出于这个理由，优选的幼虫的生长状态保持为恒定。在本专利技术的最优选的实施方案中，收集和使用的是生长于无菌状态下的新孵化幼虫的排泄/分泌物。优选地，胰凝乳蛋白酶具有如图1、图2或图13中所示的序列，或者其保留天然的或完整的胰凝乳蛋白酶活性的生物活性肽片段，其活性位点在图1、2和13中被明确。优选地，该片段与图1、2和13中所确定活性位点或者与编码胰凝乳蛋白酶肽片段的DNA具有高度同源性，例如活性位点同源性应至少为90％，优选在95％以上，更优选具有99％的同源性。理想地，片段应与肽活性位点或与编码胰凝乳蛋白酶肽片段的DNA一致。相关DNA序列示于图1、2和12中。这些序列的胰凝乳蛋白酶已经表现出具有组织再生性质和清创活性，但是不降解或消化健康的或活的组织，考虑到其与源自丽蝇皮肤蝇蛆病(一种组织退化过程)的病因体铜绿蝇的胰凝乳蛋白酶(其即使对健康的或活组织也具有众所周知的组织降解性质)具有高度同源性，这尤为令人惊奇。这种同源性在图1和2中进行了展示。本专利技术的专利技术者已经发现ES的组织重塑和再生性质在与抑制胰蛋白酶样和胰凝乳蛋白酶样丝氨酸蛋白酶的丝氨酸蛋白酶抑制剂苯甲基磺酰氟(PMSF)一起培养后就消失或被抑制了，但是在与仅抑制胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶的4-(脒基苯基)甲烷磺酰氟(APMSF)一起培养后则未消失或被抑制。-->因此，可总结出，ES中负责胞外基质重塑或组织重塑和组织再生活性的重要的甚至核心的成分是胰凝乳蛋白酶或胰凝乳蛋白酶样酶。这通过在下面将要说明的测序得到了证实，其中测定了具有双重性质的胰凝乳蛋白酶的序列。如实施方案中所示，ES的组织再生性质当该胰凝乳蛋白酶被去除时消失了，而该胰凝乳蛋白酶清除伤口焦痂，因此相同的胰凝乳蛋白酶具有组织再生和清除的双重性质。本专利技术的胰凝乳蛋白酶不仅通过清创或改进清创，还通过促进成纤维细胞迁移，基质重塑以及改变成纤维细胞形态而在治疗伤口促进其愈合方面有用途。这些相反的效果(蛋白水解和蛋白生成)存在于相同酶中的事实对本领域技术人员而言是令人惊讶的，且从现有技术中无法预见，尤其是考虑到其与来自会引起丽蝇皮肤蝇蛆病(这种病会同时破坏坏死的和活组织)的丝光绿蝇的胰凝乳蛋白酶具有高度同源性，。相应地，本专利技术提供了胰凝乳蛋白酶在用于治愈伤口的组合物中的用途。本专利技术还提供了胰凝乳蛋白酶在制备用于治愈伤口的药物中的用途，以及使用胰凝乳蛋白酶治疗伤口的方法。优选地，在组合物或药物中使用的胰凝乳蛋白酶具有图1、图2或图13中的序列，或由图1、2或12中的DNA序列编码。可选地，胰凝乳蛋白酶的活性片段可以用于这样的组合物或药物。胰凝乳蛋白酶，或其片段，可以是天然的或合成的。其优选地获取自丝光绿蝇的幼虫。本专利技术的伤口在下面定义，可以被感染或未感染。优选地，伤口是慢性的伤口，并可对传统治疗具有抗性。伤口可以通过促进成纤维细胞的迁移，通过促进基质重塑或通过改变成纤维细胞形态来进行治疗。优选地，伤口通过本专利技术的胰凝乳蛋白酶进行清创。另一方面，本专利技术还提供一种伤口敷料(dressing)，该敷料包含本专利技术前面部分所说的胰凝乳蛋白酶。相应地，本专利技术还包括一种治疗伤口的方法，该方法包括在需要治疗的伤口上应用上述敷料的步骤。本专利技术的专利技术者发现将ES与大豆胰蛋白酶抑制剂(STI)一起孵育，去除了ES增强成纤维细胞迁移的能力以及其降解胞外基质蛋白的能力。相似地，当胰凝乳蛋白酶的活性被去除时，虽然如下所述的，-->某些本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种源自昆虫幼虫的分离的胰凝乳蛋白酶或其合成形式。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】GB 2006-5-31 0610697.5;US 2006-8-15 60/837,9821.一种源自昆虫幼虫的分离的胰凝乳蛋白酶或其合成形式。
2.权利要求1的胰凝乳蛋白酶，其中该胰凝乳蛋白酶具有图1或
图13中的序列或者由图1、2或12中的DNA序列编码。
3.一种胰凝乳蛋白酶的片段，其具有与权利要求1或权利要求2
的胰凝乳蛋白酶相同的活性。
4.权利要求1至3中任一项的胰凝乳蛋白酶，其中该胰凝乳蛋白
酶获取自丝光绿蝇的幼虫。
5.前述权利要求中任一项的胰凝乳蛋白酶，其中该胰凝乳蛋白酶
来自丝光绿蝇幼虫的排泄/分泌物。
6.前述权利要求中任一项的胰凝乳蛋白酶，其中幼虫是新孵化的。
7.权利要求1至5中任一项的胰凝乳蛋白酶，其中幼虫是一龄的。
8.前述权利要求中任一项的胰凝乳蛋白酶，其中幼虫生长于无菌
环境。
9.一种用于治疗伤口的组合物，包含前述权利要求中任一项的胰
凝乳蛋白酶。
10.权利要求1至8中任一项的胰凝乳蛋白酶在制备用于治疗伤口
的药物中的用途。
11.权利要求9或10的用途，其中胰凝乳蛋白酶具有图1、图2
或图13中的序列或者由图1、2或12中的DNA序列编码。
12.权利要求9至11中任一项的用途，其中使用胰凝乳蛋白酶的
活性片段。
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【专利技术属性】
技术研发人员：DI普理查，AJ霍罗宾，A布朗，
申请(专利权)人：英国国防部，
类型：发明
国别省市：GB[英国]