一种抗氧化肽混合物及其制备方法技术

本发明专利技术公开了一种抗氧化肽混合物的制备方法，利用虾副产物，通过α‑胰凝乳蛋白酶和嗜热菌蛋白酶两步酶解，经Sephadex G‑15凝胶层析和DEAE Sephacel离子交换色谱分离得到1,1‑二苯基‑2‑苦基肼(DPPH)自由基清除能力为10.54±0.03μmol AAE/g pro，铁离子还原能力(FRAP法)为89.29±0.01μmol AAE/g pro的抗氧化肽混合物。本发明专利技术还公开了由上述方法得到的抗氧化肽混合物，分子的大小为500‑1000Da。本发明专利技术为虾副产物提供了一种新的利用途径，降低了资源浪费和污染，提升了虾副产物的商业价值和利用率。

【技术实现步骤摘要】
一种抗氧化肽混合物及其制备方法
本专利技术涉及生物
，具体涉及一种源自虾副产物的抗氧化肽混合物及其制备方法。
技术介绍
氧化反应会对食品和生物系统产生很多不利的影响，是引起食品腐败、营养品质和安全性下降的重要原因。近些年，抗氧化剂的用途越来越广泛，不仅用于含脂肪食品的氧化预防，而且作为功能因子用于保健食品及化妆品等的开发。人工合成的抗氧化剂因具有潜在的副作用而受到限制，因此天然、无毒副作用的食源性抗氧化产品更有吸引力。天然抗氧化肽是以食物蛋白为原料，通过提取、酶解或发酵，然后通过分离纯化制备的一类具有抗氧化效果的肽。虾副产物中蛋白质含量约占干重的50-60％，且氨基酸种类齐全，具有很高的营养价值，但目前利用率很低。如果能选用合适的酶对其进行酶解制备抗氧化肽，将会提高虾副产物的利用价值。因此，本领域的技术人员致力于通过酶解和纯化的方式，利用虾副产物等利用率低、商业价值小的蛋白质来源，制备抗氧化肽。
技术实现思路
本专利技术提供了一种源自虾副产物的抗氧化肽混合物及其制备方法。具体通过以下技术方案实现：本专利技术一方面提供了一种抗氧化肽混合物的制备方法，包括以下步骤：步骤1、将虾剥除虾仁后剩余的虾头与虾壳洗净、烘干、粉碎，过筛，得到虾副产物粉；步骤2、向磷酸盐缓冲液中加入上述虾副产物粉，溶解得到虾副产物总蛋白提取液；步骤3、向上述虾副产物总蛋白提取液中加入α-胰凝乳蛋白酶，混匀，进行水解反应；高温终止水解反应，离心取上清液，得到α-胰凝乳蛋白酶酶解液；步骤4、向上述α-胰凝乳蛋白酶酶解液中加入嗜热菌蛋白酶，混匀，进行水解反应；高温终止水解反应，得到嗜热菌蛋白酶酶解液；步骤5、透析上述嗜热菌蛋白酶酶解液，取透析液中500-1000Da的组分；步骤6、将上述500-1000Da的组分经凝胶层析分离，取凝胶层析分离产物中抗氧化活性最高的组分G1；步骤7、将上述组分G1经阴离子交换色谱分离，取抗氧化活性最高的组分H2。进一步地，上述步骤2具体为：称取0.4g虾副产物粉，加入到6mL磷酸盐缓冲液中，37℃摇床孵育2h，得到虾副产物总蛋白提取液。进一步地，上述步骤3具体为：向60mL虾副产物总蛋白提取液中加入24mg10000U/mgα-胰凝乳蛋白酶，漩涡混匀，在37℃下水解反应4h，90℃下终止水解反应，离心，取上清，得到α-胰凝乳蛋白酶酶解液。进一步地，上述步骤4具体为：取α-胰凝乳蛋白酶酶解液9.8mL，添加12mg175U/mL嗜热菌蛋白酶，漩涡混匀，于70℃下水解反应6h，90℃下终止水解反应，得到嗜热菌蛋白酶酶解液。进一步地，上述步骤5中，透析的具体步骤为；将嗜热菌蛋白酶酶解液放入1000Da纤维素酯膜透析袋，浸没于去离子水中透析，小于1000Da的组分扩散至去离子水中，将含有小于1000Da的组分的去离子水旋转蒸发浓缩后装入500Da纤维素酯膜透析袋内，浸没于去离子水中透析，得到袋内的500-1000Da的组分和袋外的小于500Da的组分，取500-1000Da的组分。更进一步地，两次透析的时间均为12h。进一步地，上述步骤6具体为：将500-1000Da的组分经过旋转蒸发浓缩后，用SephadexG-15(1.6cm×90cm)凝胶柱层析分离，上样量为1mL；洗脱液为去离子水，流速为0.5mL/min，按每管3mL收集，共收集100管，于214nm检测；得到三个组分G1-G3，取活性最高的第一个组分G1。进一步地，上述步骤7具体为：将洗脱组分G1收集后浓缩，用于DEAESephacel阴离子交换色谱，上样量为2mL；洗脱液为NaCl溶液(溶解在0.05mol/L，pH8.0Tris-HCl缓冲液中)，流速为0.8mL/min，每管收集4mL，按表1进行洗脱，于214nm检测其吸光值；得到四个组分H1-H4，第二个组分H2的抗氧化活性最强。表1DEAESephacel阴离子交换色谱洗脱程序进一步地，上述虾为南美白对虾。本专利技术另一方面提供了由上述制备方法得到的抗氧化肽混合物。进一步地，上述抗氧化肽混合物的DPPH自由基清除能力为10.54±0.03μmolAAE/gpro，铁离子还原能力为89.29±0.01μmolAAE/gpro，抗氧化肽混合物中分子的大小为500-1000Da。本专利技术具有如下有益效果：(1)虾副产物粉中蛋白质含量为59.94％±0.98％，有利于制备酶解液；(2)通过α-胰凝乳蛋白酶和嗜热菌蛋白酶两步酶解虾副产物得到的抗氧化酶解液的DPPH自由基清除能力为10.54±0.03μmolAAE/gpro，铁离子还原能力为89.29±0.01μmolAAE/gpro，具备较强的抗氧化功能；(3)用α-胰凝乳蛋白酶酶解4h，虾副产物蛋白的水解度达到最高值16.43％；(4)用嗜热菌蛋白酶酶解上述酶解液6h，所得酶解液的水解度达到最高值，比α-胰凝乳蛋白酶解液提高5.5％；(5)本专利技术提供的制备方法是酶解虾副产物得到抗氧化肽混合物，为虾副产物提供了一种新的利用途径，降低了资源浪费和污染，提升了虾副产物的商业价值和利用率；(6)本专利技术提供的抗氧化肽混合物，来源于食物，可应用于保健品或食物中；(7)本专利技术的制备方法步骤简单，可以用于工业生产。以下将结合附图对本专利技术作进一步说明，以充分说明本专利技术的目的、技术特征和技术效果。附图说明图1显示了本专利技术较优实施例中，经透析的各组分的抗氧化活性；图2a显示了本专利技术较优实施例中，使用SephadexG-15凝胶层析色谱对各组分进行收集时的214nm吸收值；图2b显示了洗脱组分G1-G3的抗氧化活性；图3a显示了本专利技术较优实施例中，使用DEAESephacel阴离子交换色谱对各组分进行收集时的214nm吸收值及NaCl浓度；图3b显示了洗脱组分H1-H4的抗氧化活性。具体实施方式下面结合附图和具体的实施例，并参照数据进一步详细描述本专利技术。应理解，这些实施例只是为了举例说明本专利技术，而非以任何方式限制专利技术的范围。实施例1步骤1虾副产物预处理将南美白对虾剥除虾仁后将剩余的虾头与虾壳洗净，置于恒温干燥箱中60℃烘16h，用多能粉碎机粉碎，并过60目筛。步骤2虾副产物总蛋白最佳提取时间的确定称取0.4g的虾壳粉，加入6mL磷酸盐缓冲液(0.05mol/L，pH8.0)中，37℃摇床分别孵育0.25、0.5、0.75、1、1.5、2、3、4和6h。利用Bradford试剂盒测定总蛋白液浓度。结果表明，0-2h内随着提取时间的增长，水溶性虾蛋白浓度逐渐上升，1.5h时水溶性虾蛋白浓度达到23.14％，2h时水溶性虾蛋白浓度为23.49％。此后3、4和6h得到的水溶性虾蛋白浓度无显著增长，故选取2h为虾蛋白提取时间。步骤3水解度的测定水解度(DH)的测定参考Adler-Nissen方法并进行修改：取0.1mL酶解液样品于试管中，加入2.2mL磷酸盐缓冲液(0.05mol/L，pH8.2)和2mL0.1％TNBS溶液混匀，50℃避光水浴1h。加入4mL0.1mol/L盐酸终止反应，室温静置30min，于340nm测定混合液吸光值。以不同浓度的L-亮氨酸替代样品，作标准曲线。按照下式计算：式中：ht为反应后氨基态氮浓度(mmol/g)；h0为反应前氨基态氮浓度(mmol/g)；h本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种抗氧化肽混合物的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：步骤1、将虾剥除虾仁后剩余的虾头与虾壳洗净、烘干、粉碎，过筛，得到虾副产物粉；步骤2、向磷酸盐缓冲液中加入所述虾副产物粉，溶解得到虾副产物总蛋白提取液；步骤3、向所述虾副产物总蛋白提取液中加入α‑胰凝乳蛋白酶，混匀，进行水解反应；高温终止水解反应，离心取上清液，得到α‑胰凝乳蛋白酶酶解液；步骤4、向所述α‑胰凝乳蛋白酶酶解液中加入嗜热菌蛋白酶，混匀，进行水解反应；高温终止水解反应，得到嗜热菌蛋白酶酶解液；步骤5、透析所述嗜热菌蛋白酶酶解液，取透析液中500‑1000Da的组分；步骤6、将所述500‑1000Da的组分经凝胶层析分离，取凝胶层析分离产物中抗氧化活性最高的组分G1；步骤7、将所述组分G1经离子交换色谱分离，取抗氧化活性最高的组分H2。

【技术特征摘要】
1.一种抗氧化肽混合物的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：步骤1、将虾剥除虾仁后剩余的虾头与虾壳洗净、烘干、粉碎，过筛，得到虾副产物粉；步骤2、向磷酸盐缓冲液中加入所述虾副产物粉，溶解得到虾副产物总蛋白提取液；步骤3、向60mL所述虾副产物总蛋白提取液中加入24mg10000U/mgα-胰凝乳蛋白酶，漩涡混匀，在37℃下水解反应4h，90℃下终止水解反应，离心，取上清，得到所述α-胰凝乳蛋白酶酶解液；步骤4、向所述α-胰凝乳蛋白酶酶解液中加入嗜热菌蛋白酶，混匀，进行水解反应；高温终止水解反应，得到嗜热菌蛋白酶酶解液；步骤5、透析所述嗜热菌蛋白酶酶解液，取透析液中500-1000Da的组分；透析的具体步骤为；将所述嗜热菌蛋白酶酶解液放入1000Da纤维素酯膜透析袋，浸没于去离子水中透析，小于1000Da的组分扩散至去离子水中，将含有小于1000Da的组分的去离子水旋转蒸发浓缩后装入500Da纤维素酯膜透析袋内，浸没于去离子水中透析，得到袋内的500-1000Da的组分和袋外的小于500Da的组分，取所述500-1000Da的组分；步骤6、将所述500-1000Da的组分经凝胶层析分离，取凝胶层析分离产物中抗氧化活性最高的组分G1；步骤7、将所述组分G1经离子交换色谱分...

【专利技术属性】
技术研发人员：张建华，刘亚楠，钱炳俊，姚晓敏，亚力坤江·阿山，王延辉，
申请(专利权)人：上海交通大学，
类型：发明
国别省市：上海;31