一种MTF1基因的靶向抑制剂及其用途制造技术

本发明专利技术属于医药技术领域，具体涉及一种MTF1基因的抑制剂及其用途。一种MTF1基因的靶向抑制剂，其特征在于该靶向抑制剂的基因序列为：5’‑GGATACAAATCACTCACTTTG‑3’（SEQ ID No.1）。该抑制剂可以抑制MTF1基因在脑胶质细胞中的表达，从而起到治疗脑胶质瘤的作用，具有广泛的应用前景。

A target inhibitor for MTF1 gene and its use

The present invention belongs to the field of medical technology, in particular to an inhibitor of MTF1 gene and its use. Targeting an inhibitor of the MTF1 gene, which is characterized in that the target gene sequence inhibitor: 5 \GGATACAAATCACTCACTTTG 3\ (SEQ ID No.1). The inhibitor can inhibit the expression of MTF1 gene in brain glial cells, and thus play a role in the treatment of glioma, and it has a wide application prospect.

【技术实现步骤摘要】
一种MTF1基因的靶向抑制剂及其用途
本专利技术属于医药
，具体涉及一种MTF1基因的靶向抑制剂及其用途。
技术介绍
恶性脑胶质瘤是中枢系统最常见的恶性肿瘤，占原发性脑肿瘤的50%-60%。目前治疗手段主要以手术为主，放化疗为辅助治疗。但是，由于胶质瘤具有侵袭性生长的生物学特征，并且胶质瘤级别越高，侵袭性越强，手术即使达到影像学和显微镜下全切，复发还是在所难免。目前主流的手术加术后同步放疗后统计显示其中位生存期仅为12个月，5年生存率不足13%。高级别神经胶质瘤预后更差，如多形性胶质母细胞瘤（Glioblastomamultiforme,GBMs）的疗效仍然很差，生存中位数仍然不超过15个月。为了提高治疗的有效性，解决其复发以及治疗抵抗的问题，从基因与分子水平上研究神经胶质瘤的发病机制，寻找新的生物标志和治疗靶点显得尤为的重要。MTF1(metalregulatorytranscriptionfactor1)，是一种独特的Cys2His2锌指蛋白，从果蝇到人类进化上较为保守。研究表明，MTF1在肺癌、宫颈癌、乳腺癌[和结直肠癌中高表达，发挥促癌基因的作用。目前尚未发现MTF1在恶性脑胶质瘤中的表达并参与胶质瘤细胞生物学行为的调控。前期，我们应用real-timePCR法检测了MTF1的表达水平。结果显示，在脑胶质细胞中MTF1的表达水平显著高于正常星型胶质细胞组，这一结果提示MTF1可能参与对胶质瘤的发生与发展的功能调控。RNA干扰技术的原理是利用Dicer酶切割RNA分子，形成RNA沉默复合体，靶向结合目标RNA分子进而降解RNA分子的过程。本专利技术希望利用RNA干扰技术研制MTF1基因的抑制剂，在胶质瘤基因治疗领域发挥作用。目前，MTF1基因在胶质瘤发生发展中的作用以及相关机制还未见报道，关于MTF1在胶质瘤基因治疗方面的应用目前还一片空白。因此，研制一种MTF1相关的药物成为目前亟待解决的问题。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种MTF1基因的抑制剂，该抑制剂可以抑制MTF1基因在脑胶质瘤细胞中的表达，从而起到治疗脑胶质瘤的作用，具有广泛的应用前景。为了实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案：本专利技术提供了一种MTF1基因的靶向抑制剂，该靶向抑制剂的基因序列为：5’-GGATACAAATCACTCACTTTG-3’（SEQIDNo.1）。本专利技术进一步提供了该靶向抑制剂能够抑制MTF1基因表达的shRNA序列，所述shRNA模板序列包括正义链和反义链，所述正义链和反义链分别为：正义链：5’-CACCGGATACAAATCACTCACTTTGTTCAAGAGACAAAGTGAGTGATTTGTATCCTTTTTTG-3’（SEQIDNo.2）。反义链：5’-GATCCAAAAAAGGATACAAATCACTCACTTTGTCTCTTGAACAAAGTGAGTGATTTGTATCC-3’（SEQIDNo.3）。进一步地，本专利技术提供了一种转录上述的shRNA的转录产物，序列为：5’-GGATACAAATCACTCACTTTGTTCAAGAGACAAAGTGAGTGATTTGTATCC-3’（SEQIDNo.4）。优选的，该抑制剂为任何药物治疗学上可接受的的剂型。优选的，该抑制剂的剂型为注射制剂。优选的，该抑制剂为任何药物治疗学上可接受的的剂量。一种MTF1基因抑制剂作为制备用于治疗人脑胶质瘤药物中的应用。与现有技术相比，本专利技术具有如下技术效果。1、本专利技术靶向抑制剂特异性强，特异性抑制MTF1基因的表达。2、MTF1基因抑制剂靶向治疗，能显著降低传统治疗药物的耐药问题，为胶质瘤治疗提供新靶点。3、实验已证明在体外细胞学水平上应用，治疗效果确切，无不良反应发生。附图说明图1为Real-timePCR方法检测MTF1在正常胶质细胞（HA）、胶质瘤细胞(U251、U87)中的表达水平柱状图。图2为Westernblot检测MTF1在正常胶质细胞（HA）、胶质瘤细胞(U251、U87)中的蛋白表达水平电泳和柱状图。图3为CCK-8细胞活力法检测应用MTF1基因抑制剂后，抑制U87、U251胶质瘤细胞增殖的柱状图。图4为Transwell检测应用MTF1基因抑制剂后,抑制胶质瘤细胞U87、U251迁移、侵袭能力的照片和柱状图。图5为流式细胞仪检测应用MTF1基因抑制剂后，促进胶质瘤细胞U87、U251凋亡的照片和柱状图。具体实施方式本专利技术主要技术方案是。1.shRNA的设计和干扰载体的制备。2.Westernblot3.干扰效率的验证。4.细胞增殖实验。5.细胞迁移、侵袭实验。6.流式细胞仪检测细胞凋亡实验。实施例1一、U87、U251胶质瘤细胞的培养。(1)U87、U251细胞均用含10%胎牛血清的DMEM高糖培养基培养。倒置显微镜下观察细胞，细胞汇合度80%-90%时传代；(2)弃掉原瓶中的培养液，用室温预温的PBS洗2遍，吸弃PBS；(3)加入预温的0.25%胰蛋白酶消化液约1ml，置于显微镜下观察。当细胞突起消失，细胞形状变圆时，立即弃消化液，用含有10%胎牛血清的DMEM高糖培养基终止消化；(4)用移液器将细胞吹打成单细胞悬液，按1：3比例传代，置于37℃、5%CO2的恒温培养箱中培养；(5)复苏的细胞经过3次传代后便可以进行后续实验。二、实时定量PCR检测MTF1的表达。（1）Trizol法分别提取正常胶质细胞（HA）、胶质瘤细胞(U251、U87)细胞中的总RNA。用冷PBS洗涤收集的细胞，加入1mlTrizol试剂吹打数次，镜下观察细胞成油滴状（充分裂解），后移入1.5mlEP管中，静置5分钟，使其充分裂解；向样品中加入0.2ml氯仿，手动剧烈震荡室温下静置3分钟；于4℃12000g离心15分钟，取上层水相到新的EP管中，再加入0.5ml异丙醇，上下颠倒混匀，室温下静置10分钟；4℃12000g离心15分钟后弃上清，加入1ml75%乙醇；4℃7500g离心5分钟，干燥15分钟后加入40μlDEPC水，样品可冻存于-80℃冰箱。（2）一步染料法qRT-PCR检测MTF1的表达：测定CT值，以GAPDH为内参照，以2-△△Ct表示MTF1的相对表达量，结果如附图1所示，证实MTF1在胶质瘤细胞中的表达显著上调。三、Westernblot检测MTF1在正常胶质细胞（HA）、胶质瘤细胞(U251、U87)中的表达。(1)收集细胞，加入RIPA蛋白裂解液，震荡摇匀，冰上静置30min,4℃条件下12000g离心30min；(2)获得并收集上清并采用BCA法测定样品的蛋白浓度；(3)取40mg蛋白与5x上样缓冲液混合(1:4)，煮沸5min变性；(4)将变性蛋白加入8-10%不等的SDS变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离；(5)转膜：电压100V，电流120mA,90min-200min；(6)5%脱脂牛奶封闭2h；(7)一抗稀释液以一定比例稀释相关抗体封膜，4°C过夜；(8)TTBS洗5min，3次，加相应二抗，室温摇床上孵育2h；(9)ECL发光，照相，quantityone软件定量分析。检测MTF1基因在正常星形胶质细胞（HA）、胶质瘤细胞(U251、U87)的蛋白表达水平，证实MTF1在胶质瘤细胞中的本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种MTF1基因的靶向抑制剂，其特征在于，该靶向抑制剂的基因序列为：5’‑GGATACAAATCACTCACTTTG‑3’（SEQ ID No.1）。

【技术特征摘要】
1.一种MTF1基因的靶向抑制剂，其特征在于，该靶向抑制剂的基因序列为：5’-GGATACAAATCACTCACTTTG-3’（SEQIDNo.1）。2.根据权利要求1所述的一种MTF1基因的靶向抑制剂，其特征在于，该靶向抑制剂能够抑制MTF1基因表达的shRNA序列，所述shRNA模板序列包括正义链和反义链，所述正义链和反义链分别为：正义链：5’-CACCGGATACAAATCACTCACTTTGTTCAAGAGACAAAGTGAGTGATTTGTATCCTTTTTTG-3’（SEQIDNo.2）；反义链：5’-GATCCAAAAAAGGATACAAATCACTCACTTTGTCTCTTGAACAAAGTGAGTGATTTGTATCC-3’（SEQIDN...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘云会，薛一雪，蔡恒，郑健，刘啸白，阮雪雷，李振，马珺，王振华，奚卓，刘丽波，陈佳佳，王萍，巩威，
申请(专利权)人：中国医科大学附属盛京医院，
类型：发明
国别省市：辽宁,21