一种分子、表达其的细胞及其制备方法和用途技术

提供一种嵌合的免疫抑制检查点受体分子，编码其的核酸，含有该核酸的构建体、表达载体和转化的细胞，以及它们的制药用途。嵌合的免疫抑制检查点受体分子包含胞外结构域、跨膜结构域和胞内结构域，所述胞外结构域和任选地跨膜结构域为免疫抑制检查点受体分子的相应结构域或基于该结构域进行的基因改造，所述胞内结构域为一个或多个免疫激活信号结构域。转化的细胞具有强肿瘤杀伤作用，且可解除肿瘤免疫抑制微环境，增强肿瘤微环境中的免疫作用；并且，该转化的细胞有自调节功能，可缓解过度的非特异免疫效应和细胞因子风暴等副作用。

A molecule, the cells expressed and their preparation methods and uses

A chimeric immunosuppressant checkpoint receptor molecule is provided, which encodes its nucleic acid, including the construction of the nucleic acid, expression vector and transformed cells, and their pharmaceutical uses. Chimeric immune inhibitory checkpoint receptor molecules containing extracellular domain, transmembrane domain and cytoplasmic domain, the corresponding domain of the extracellular domain and optionally transmembrane domain as immunosuppressive checkpoint receptor molecules or the domain based on the gene transformation, the intracellular domain for one or more immune activation signal domain. The transformed cells have strong antitumor effect, and can relieve the tumor microenvironment of immune suppression and immune function in tumor microenvironment; and the transformed cells have self regulating function, can alleviate the excessive non-specific immune response and cytokine storm and other side effects.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】一种分子、表达其的细胞及其制备方法和用途
本专利技术涉及肿瘤的细胞免疫治疗
，具体地，涉及一种嵌合的免疫抑制检查点受体分子，编码其的核酸，含有该核酸的构建体、表达载体和转化的细胞，以及它们的制药用途。
技术介绍
CAR-T细胞肿瘤治疗现状2015年10月，国家癌症中心在著名癌症专业期刊《CancerLetters》上首次发布我国居民癌症现患数据。结果显示，我国5年内诊断为癌症且仍存活的病例数约为749万(其中男性患者368万人，女性患者381万人)，总体5年癌症患病率为556/10万，数据从整体上反映了癌症病人对新治疗研究进展的迫切需求。而免疫疗法已然成为人类对抗癌症新的希望，而CAR-T治疗血液肿瘤特别是B-ALL白血病的临床试验结果，使其成为了近年来最备受瞩目的肿瘤免疫疗法之一。然而靶向实体瘤的CART免疫治疗研究仍然面对巨大的考验：如何突破实体瘤组织壁垒、如何抵抗肿瘤组织内的免疫抑制、免疫细胞如何在缺氧微环境中竞争生存等。肿瘤治疗的难题，特别是实体瘤及其肿瘤微环境中的免疫抑制作用肿瘤微环境可下调肿瘤抗原特异性的辅助/毒性杀伤细胞的数量和炎症因子的释放，上调免疫抑制细胞数量和抑制功能，如调节性T细胞(RegulatoryTcells)和髓系来源的抑制细胞(Myeloid-DerivedSuppressorCells)，将正常免疫系统颠覆为促进肿瘤自身生长的优势因素。针对肿瘤免疫抑制的相应措施现状针对实体瘤免疫抑制的情况，科学家陆续研发出阻断抑制信号通路，下调肿瘤微环境中的抑制性细胞的方法，如特异性靶向PD-1(ProgrammedDeath1)、PD-L1(ProgrammedDeathLigand1)、CTLA4(CytotoxicT-Lymphocyte-associatedAntigen-4)抗体或抑制剂，免疫激活因子等。在现有技术中，将免疫抑制相关抗原PD-1和CTLA-4应用于肿瘤免疫治疗的手段通常是构建PD-1抗体(Pembrolizumab、Nivolumab)或CTLA-4抗体(Ipilimumab)，或者使用PD-1或CTLA-4的抑制剂或信号通路阻断剂。然而，PD-1抗体和CTLA-4抗体存在一定的限制性，即，抗体需要渗入肿瘤组织中才可发挥疗效，所以抗体的临床应用具有不确定性。据报道，CAR-GD2T细胞联合PD-1抗体进行免疫治疗时，可抵抗肿瘤微环境的免疫抑制作用，加强CART细胞肿瘤杀伤。对于PD-1和CTLA-4的免疫治疗应用，现有技术中也报道了共表达靶向肿瘤相关抗原CART和抑制性CART(胞外抗原为正常细胞抗原，胞内段为PD-1或者CTLA-4的抑制信号域)，可防止CART脱靶现象的发生(脱靶现象：CART细胞识别杀伤正常细胞)。另外，现有技术中还报道了共表达双抗体PD-1和CD19/Mesothelin/PSCA的CART，这虽然扩大了靶点范围(表达PD-1或CD19/Mesothelin/PSCA或同时表达两者的肿瘤细胞)，但是忽略了盲目增加细胞杀伤作用所引起的副作用：细胞因子风暴、脱靶现象(正常细胞也表达两个抗原或之一，导致CART杀伤正常细胞，引起正常细胞缺失的机体功能缺陷)。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种嵌合的免疫抑制检查点受体分子，编码其的核酸，含有该核酸的构建体、表达载体和转化的细胞，以及它们的制药用途。本专利技术的表达所述嵌合的免疫抑制检查点受体分子的转化的细胞可营造一种肿瘤免疫抑制微环境，具有增强的肿瘤杀伤作用；并且，该转化的细胞有自调节功能，可缓解过度的非特异免疫效应和细胞因子风暴等副作用。本专利技术通过以下技术方案实现上述目的：第一方面，本专利技术提供了一种嵌合的免疫抑制检查点受体分子，其包含胞外结构域、跨膜结构域和胞内结构域，其中，所述胞外结构域和任选地跨膜结构域为免疫抑制检查点受体分子的相应结构域或基于该结构域进行的基因改造，所述胞内结构域为一个或多个免疫激活信号结构域。作为优选，所述免疫抑制检查点受体分子选自PD-1、CTLA-4、LAG3、TIM3、A2AR、B7H3、B7H4、BTLA、IDO、KIR、CD160、2B4(CD244)和VISTA(C10orf54)；进一步优选地，所述免疫检查点受体分子为PD-1、CTLA-4、LAG3或TIM3。优选地，所述胞内结构域包含免疫共刺激信号组合和任选的信号肽；进一步优选地，所述免疫共刺激信号组合包含TLR1和/或TLR2信号结构域；进一步优选地，所述胞内结构域为TLR1和/或TLR2与41BB和/或CD28信号结构域的组合。进一步优选地，任选的信号肽为免疫抑制检查点受体分子相对应的信号肽。进一步优选地，所述胞内结构域还包括CD3ζ胞内结构域；在具体的优选实施方案中，所述TLR1和/或TLR2信号结构域和任选地41BB和/或CD28信号结构域配置在CD3ζ胞内结构域的N末端侧。第二方面，本专利技术提供了编码如第一方面所述的嵌合的免疫抑制检查点受体分子的核酸。第三方面，本专利技术提供了一种核酸构建体，其包含如第二方面所述的核酸，以及与之可操作连接、可指导所述嵌合的免疫抑制检查点受体分子在宿主细胞中表达的一个或多个控制序列。第四方面，本专利技术提供了一种表达载体，其包含如第三方面所述的核酸构建体；优选地，所述表达载体为慢病毒表达载体。第五方面，本专利技术提供了一种转化的细胞，其包含如第二方面所述的核酸，或者其中转化了如第三方面所述的核酸构建体或如第四方面所述的表达载体；优选地，所述转化的细胞为免疫细胞，进一步优选为T细胞、B细胞或NK细胞。在具体的实施方案中，所述转化的细胞为宙斯盾细胞毒性T淋巴细胞(S-CTL,ZeushieldCytotoxicTLymphocyte)，其为过表达免疫抑制向激活转型的检查点分子的淋巴细胞，特别是T淋巴细胞。S-CTL细胞包括表达嵌合的PD-1受体分子的SP-CTL细胞、表达嵌合的CTLA-4受体分子的SC-CTL细胞、表达嵌合的TIM3受体分子的ST-CTL细胞和表达嵌合的LAG3受体分子的SL-CTL细胞等。S-CTL细胞通过在人体T细胞中转染嵌合的免疫抑制-激动转型的检查点分子基因，获得可抵抗免疫抑制的淋巴细胞。S-CTL淋巴细胞具有以下特点：1)对表达免疫抑制检查点分子的配体(如PD-L1、B7.1、B7.2、Galectin-9、MHCII等)的肿瘤细胞或肿瘤相关免疫抑制细胞具有强效细胞杀伤作用；2)S-CTL包含天然的免疫抑制检查点受体分子(如PD-1、CTLA-4、TIM3、LAG3等)表达在免疫效应细胞特别是T细胞、NK细胞等表面，与肿瘤细胞或肿瘤相关免疫抑制细胞的配体结合后，可激活S-CTL载体下游的免疫激活信号，促进免疫细胞自身的激活、增殖、识别、杀伤等功能的发挥；3)S-CTL结构：胞外段和跨膜区域为完全天然的免疫抑制检查点分子结构，用于特异性识别肿瘤细胞表面配体及识别信号在S-CTL细胞内的有效传递；胞内区域为一个或多个免疫激活信号域，其中本专利技术发现含TLR1和/或TLR2信号激活域的胞内结构域，可进一步促进肿瘤杀伤效应；4)自调节功能，由于正常淋巴细胞表达天然的免疫抑制检查点分子受体，转化的细胞表达嵌合的免疫抑制-激动转型的检查点分子，而天然本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种嵌合的免疫抑制检查点受体分子，其包含胞外结构域、跨膜结构域和胞内结构域，其中，所述胞外结构域和任选地跨膜结构域为免疫抑制检查点受体分子的相应结构域或基于该结构域进行的基因改造，所述胞内结构域为一个或多个免疫激活信号结构域。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.06.20 CN 20161044307371.一种嵌合的免疫抑制检查点受体分子，其包含胞外结构域、跨膜结构域和胞内结构域，其中，所述胞外结构域和任选地跨膜结构域为免疫抑制检查点受体分子的相应结构域或基于该结构域进行的基因改造，所述胞内结构域为一个或多个免疫激活信号结构域。2.根据权利要求1所述的免疫抑制检查点受体分子，其特征在于，所述免疫抑制检查点受体分子选自PD-1、CTLA-4、LAG3、TIM3、A2AR、B7H3、B7H4、BTLA、IDO、KIR、CD160、2B4(CD244)和VISTA(C10orf54)；优选地，所述免疫检查点受体分子为PD-1、CTLA-4、LAG3或TIM3。3.根据权利要求1或2所述的免疫抑制检查点受体分子，其特征在于，所述胞内结构域包含免疫共刺激信号胞内域组合和任选的信号肽；优选地，所述免疫共刺激信号组合包含TLR1和/或TLR2信号结构域；进一步优选地，所述胞内结构域为TLR1和/或TLR2与41BB和/或CD28等信号结构域的组合；优选地，任选的信号肽为免疫抑制检查点受体分子相对应的信号肽。4.根据权利要求3所述的免疫抑制检查点受体分子，其特征在于，所述胞内结构域还包括CD3ζ胞内结构域；优选地，所述TLR1和/或TLR2信号结构域和任选地41BB和/或CD28信号结构域配置在CD3ζ胞内结构域的N末端侧。5.编码如权利要求1-4任一项所述的嵌合的免疫抑制检查点受体分子...

【专利技术属性】
技术研发人员：不公告发明人，
申请(专利权)人：深圳市体内生物医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44