一种基于蛋白互作用于检测细胞PD1表达情况的融合蛋白及其应用制造技术

本发明专利技术涉及一种基于蛋白互作用于检测细胞PD1表达情况的融合蛋白及其应用，属于生物检测技术领域。本发明专利技术融合蛋白，其特征在于由PDL1蛋白的结合区片段第18－132位氨基酸与GFP绿色荧光蛋白通过连接肽结合而得到。实验表明，本发明专利技术的融合蛋白既保证了PDL1与PD1的结合，又确保不会因为结合而引发程序性死亡。该融合蛋白用于PD1检测，与传统的抗体检测比较，具有效率高、成本低和更灵敏的优点，是一种快速、高效、精准的检测PD1的新方法。

【技术实现步骤摘要】
一种基于蛋白互作用于检测细胞PD1表达情况的融合蛋白及其应用
本专利技术涉及生物
，特别是涉及一种检测细胞PD1表达情况的融合蛋白及其应用。
技术介绍
程序性死亡受体-1(programmedcelldeathprotein-1，PD1/CD279)是重要的免疫检查点，通过与其两个配体PDL1(B7-H1/CD274)和PDL2(B7-DC/CD273)的作用而抑制T细胞的活化及细胞因子的产生，在维持机体的外周耐受上发挥至关重要的作用。免疫检查点本是人体免疫系统中起保护作用的分子，起类似刹车的作用，防止T细胞过度激活导致的炎症损伤等。而肿瘤细胞利用人体免疫系统这一特性，通过过度表达免疫检查点分子，抑制人体免疫系统反应，逃脱人体免疫监视与杀伤，从而促进肿瘤细胞的生长。目前临床上研究和应用最广泛的免疫检查点抑制剂包括CTLA-4、PD1和PDL1单抗，通过抑制免疫检查点活性，释放肿瘤微环境中的免疫刹车，重新激活T细胞对肿瘤的免疫应答效应，从而达到抗肿瘤的作用。淋巴细胞上PD1的表达情况是临床检查、用药指导的重要标志物(biomarker)之一，目前市售的检测PD1的抗体有以下缺点：1.成本高，抗体的研发成本和生产成本较高；2.不灵敏，由于PD1抗体药物发展，高效灵敏的抗体，多用于开发治疗性药物；3.非特异结合，抗体本身易产生非特异结合，影响结果。4.检测结果难以统一，由于每个抗体的识别区不同，结合力不同，因此可能发生由于抗体不同而直接导致结果不同的现象发生。因此，急需开发稳定高效低廉的流式抗体替代品。由于PDL1和PD1是天然存在的配体和受体，且以PDL1检测PD1能够最真实的反应可能受到免疫检查点影响的淋巴细胞的情况，但由于PDL1与PD1结合后，可以启动程序性死亡，因此简单的以PDL1作为检测PD1的方法尚不可行。
技术实现思路
针对上述领域中的缺陷，提供一种融合蛋白，该蛋白既保证了PDL1与PD1的结合，又确保不会因为结合而引发程序性死亡。同时本专利技术还提供该融合蛋白在检测PD1表达情况中的应用。与传统的抗体检测比较，具有效率高、成本低和更灵敏的优点，是一种快速、高效、精准的检测PD1的新方法。一种融合蛋白，其特征在于由PDL1蛋白的结合区片段第18－132位氨基酸与GFP绿色荧光蛋白通过连接肽结合而得到。所述连接肽序列为：GGGGSGGGGSGGGGS、HHHHPGGSVKKR、SAPGTP、SAPGTPSR或PG。所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO：1所示。PDL1-GFP:AFTVTVPKDLYVVEYGSNMTIECKFPVEKQLDLAALIVYWEMEDKNIIQFVHGEEDLKVQHSSYRQRARLLKDQLSLGNAALQITDVKLQDAGVYRCMISYGGADYKRITVKVNAGGGGSGGGGSGGGGSMSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTFGYGVQCFARYPDHMKQHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNYNSHNVYIMADKQKNGIKVNFKIRHNIEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSALSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITHGMDELYK上述融合蛋白在检测细胞PD1表达情况中的应用。本专利技术基于PD1和PDL1互作的三维立体结构，分析PDL1上参与结合的氨基酸区域为18位到132位氨基酸序列，将PDL1蛋白的结合区片段与GFP绿色荧光蛋白通过连接肽融合，实验表明，本专利技术的融合蛋白既保证了PDL1与PD1的结合，又确保不会因为结合而引发程序性死亡。与传统的抗体检测比较，具有效率高、成本低和更灵敏的优点，是一种快速、高效、精准的检测PD1的新方法。附图说明图1PDL1与PD1互作的三维结构，图2电泳分析PCR扩增结果，其中1：PDL118-132；2：PD1全长；3：GFP；4：pET28a，图3SDS-PAGE电泳分析蛋白表达结果，图4质谱鉴定结果，图5SDS-PAGE电泳分析蛋白表达及纯化结果，其中1:空载体沉淀；2:PDL1-GFP蛋白沉淀；3:空载体上清；4:PDL1-GFP蛋白上清；5:流穿样品；6:Washingbuffer洗脱样品；7:ElutionI洗脱的前2mL；8:ElutionI洗脱样品；9:ElutionII洗脱样品图6SDS-PAGE电泳分析蛋白表达及纯化结果，1:空载体上清；2:PDL1-GFP蛋白上清；3:流穿样品；4、5:Washingbuffer洗脱样品；6:ElutionII洗脱的前2mL；7、8:ElutionII洗脱样品；9:H2O洗脱样品，图7SDS-PAGE电泳分析蛋白表达及纯化结果，1:空载体上清；2:PDL1-GFP蛋白上清；3:流穿样品；4、5:Washingbuffer洗脱样品；6:ElutionII洗脱的前2mL；7、8:ElutionII洗脱样品；9:H2O洗脱样品，图8PDL1-GFP蛋白纯化(G25脱盐)，图9SDS-PAGE电泳分析蛋白表达及纯化结果，其中1－5:洗脱峰；6:纯化前蛋白图10流式检测PBMC凋亡情况，图11流式细胞仪检测PD1表达情况，其中1－阴性对照，2－流式抗体，3－PDL1-GFP，图12荧光显微镜观察细胞PD1表达情况。具体实施方式下面结合实施例对本专利技术做进一步的详细说明。下述实验材料均为市售。实施例1实验方法：1、PDL1上参与结合的区域结构分析根据解析的PDL1和PD1互作时的三维结构(图1)，分析PDL1上参与结合的氨基酸区域为18位到132位氨基酸序列(框内)，其中红色标出的为结合位点。参与结合的氨基酸序列为18AFTVTVPKDLYVVEYGSNMTIECKFPVEKQLDLAALIVYWEMEDKNIIQFVHGEEDLKVQHSSYRQRARLLKDQLSLGNAALQITDVKLQDAGVYRCMISYGGADYKRITVKVNA132，标记为：PDL118-132。PDL1-GFP融合蛋白氨基酸序列设计PDL1-GFP:AFTVTVPKDLYVVEYGSNMTIECKFPVEKQLDLAALIVYWEMEDKNIIQFVHGEEDLKVQHSSYRQRARLLKDQLSLGNAALQITDVKLQDAGVYRCMISYGGADYKRITVKVNAGGGGSGGGGSGGGGS(HHHHPGGSVKKR)(SAPGTP)(SAPGTPSR)(PG)*MSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTFGYGVQCFARYPDHMKQHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNYNSHNVYIMADKQKNGIKVNFKIRHNIEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSALSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITHGMDELYK*：()中本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种融合蛋白，其特征在于由PDL1蛋白的结合区片段第18－132位氨基酸与GFP绿色荧光蛋白通过连接肽结合而得到。

【技术特征摘要】
1.一种融合蛋白，其特征在于由PDL1蛋白的结合区片段第18－132位氨基酸与GFP绿色荧光蛋白通过连接肽结合而得到。2.根据权利要求1所述的融合蛋白，所述连接肽序列为：GGGGSGGGGSGGGGS、HHH...

【专利技术属性】
技术研发人员：张嵘，周子珊，解佳森，
申请(专利权)人：北京鼎成肽源生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11