【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于基因编辑领域，具体涉及敲除nk细胞的tigit基因的方法、tigit基因敲除的nk细胞及应用，特别涉及能够高效敲除nk细胞的tigit基因的方法以及由该方法获得的tigit敲除表达的nk细胞，还提供了包含nk细胞的免疫治疗产品、在制备用于肿瘤治疗的制剂中的用途等。
技术介绍
1、自然杀伤(natural killer，nk)细胞是人体天然免疫细胞中的重要组分，由造血干细胞分化而来，作为机体的第一道防线识别并攻击外来病原体和体内肿瘤细胞，是固有免疫系统的重要组成部分。同时，nk细胞与获得性免疫系统的b细胞和t细胞均为淋巴细胞家族成员，其被激活后所释放出的ifnγ能够诱导细胞表面mhc类分子的表达，放大抗原提呈作用，因此nk细胞能作为桥梁连接起固有免疫与获得性免疫两大系统。
2、nk细胞表面不表达特异性抗原识别受体，不受mhc分子的限制，无需预先致敏就能通过多种方式直接杀伤肿瘤细胞，这些方式包括：1.释放穿孔蛋白和颗粒酶素致使肿瘤细胞溶解；2.释放tnf作用于肿瘤细胞表面的tnf受体，致使细胞凋亡；3.nk细胞表面配体(fasl或trail)能与肿瘤细胞表面受体(fas或trailr)结合并诱导其凋亡；4.nk细胞表面的fc受体(cd16，fcriiiγ)能与抗体结合，发挥抗体依赖的细胞毒(adcc)作用。
3、因此，自然杀伤(natural killer，nk)细胞在防御疾病包括恶性肿瘤第一防线中能发挥重要作用。与获得性免疫系统的细胞(例如t细胞)相比，nk细胞无需预先刺激或致敏即可启动细胞毒
4、nk细胞可以通过细胞表面tcr和相关的cd3分子的缺失，以及cd56的表达来鉴定。nk细胞主要在血液中循环，约占外周血单个核细胞(pbmc)的5～10％，也存在于骨髓和脾脏等淋巴组织中。
5、在肿瘤治疗中，通过在体外制备对肿瘤具有杀伤功能的nk细胞，然后将nk细胞回输给患者，在患者体内实现对肿瘤细胞的杀伤，从而达到治疗效果。因此，获得足够数量的、杀伤性强、质量稳定的nk细胞，是实现nk细胞肿瘤治疗临床应用的关键。但是，由于来源于外周血的nk细胞难以在体外大量扩增，并且从外周血分离纯化nk细胞存在一定技术难度，例如难以避免来自t淋巴细胞的污染，无法获取大量的、均一的nk细胞并达到临床所需的标准，因此这也成为nk细胞不能广泛应用于临床的障碍；此外，在有些肿瘤患者病例中，nk细胞介导的抗肿瘤反应较弱，这可能与nk细胞杀伤能力差、在体内存活能力差或向肿瘤部位迁移受限等因素有关。
6、tigit(t cell immunoreceptor with immunoglobulin and itim domains)是nk细胞抑制靶点之一，有研究显示，如果封闭nk细胞tigit靶点，能够阻止nk细胞的耗竭，增强nk细胞的抗肿瘤活性。在nk细胞方面，有研究还表明耗竭型nk细胞大量表达tigit而不是pd-1，无论是在小鼠体内敲除tigit基因，还是用抗体阻断tigit/pvr信号通路，都能够增强nk细胞的抗肿瘤活性，延长荷瘤小鼠的生存期。尽管抗tigit抗体在动物水平的研究中展现出了理想的疗效，但有关tigit抗体的临床试验还为数不多。在最近的一项随机、双盲临床试验中，使用抗tigit抗体联合阿替利珠单抗一线治疗pd-l1阳性非小细胞肺癌患者，发现抗tigit抗体联合阿替利珠单抗的客观缓解率(orr)仅为37％，相对于安慰剂+阿替利珠单抗组仅提高了16％，可见目前的抗tigit抗体的临床疗效仍然十分有限，这可能与抗体难以到达肿瘤局部，或是到达肿瘤局部的抗体不足以完全阻断tigit/pvr信号通路有关，因此这一局限很大程度上制约了tigit这一靶点的免疫检查点阻滞疗法的开发和应用。
7、基因编辑技术是研究功能基因组的重要技术手段，目前已经发展了四代基因编辑技术，包括大范围核酸酶、锌指核酸酶、转录激活因子样效应物核酸酶、crispr等，其中crispr系统因其高效、廉价而被广泛应用。crispr/cas12a是一种来源于原核生物的新型核酸酶系统，它由导向序列sgrna和核酸酶cas12a两种元件组成，目前采用crispr/cas12a系统已经在来源于多个种属的诸多细胞中成功实现了基因敲除，但至今未见对nk细胞中tigit基因进行敲除的相关报道。
8、因此，寻找活性强的nk细胞以及建立体外大规模可供异体使用的培养体系是nk细胞过继免疫治疗肿瘤能够应用于临床中的亟需解决的问题。建立易于操作、质量可控、产量高、产物活性高、成本低的nk细胞大规模连续培养及制备工艺可解决细胞免疫治疗技术所面临的瓶颈难题，使细胞治疗产品有可能像药物一样批量化、规模化、均一化、流程化生产。
技术实现思路
1、鉴于现有技术中存在的问题，本专利技术旨在提供一种高效敲除nk细胞的tigit基因的方法，以及由该方法获得的tigit敲除的nk细胞，以提高nk细胞对肿瘤细胞的识别和杀伤活性，使其能够开发成安全有效的抗肿瘤生物制剂，为过继免疫治疗肿瘤及病毒感染性疾病提供新的生物制剂。
2、本专利技术提供了一种敲除nk细胞的tigit基因的方法，所述方法包括治疗目的和非治疗目的的方法，利用crispr/cas12a基因编辑系统，以电穿孔转染方式将sgrna与cas12a蛋白的复合物导入经扩增培养的nk细胞中，所述sgrna的序列选自seq id no.1、seq idno.2或seq id no.3所示序列组成的组中的至少一者。
3、本专利技术提供了nk细胞，所述nk细胞为tigit基因被敲除和/或其表达受到抑制的nk细胞。
4、在一些实施方案中，所述tigit基因的表达通过crispr/cas12a技术被敲除。
5、在一些实施方案中，所述nk细胞是以rnp复合物对目标位点进行敲除后的nk细胞，所述目标位点为tigit基因，所述rnp复合物包括cas12a蛋白和sgrna，所述sgrna的序列选自由seq id no.1、seq id no.2和seq id no.3所示序列组成的组中的至少一者。
6、在一些实施方案中，所述rnp复合物中，sgrna与cas12a蛋白的摩尔比为约1:(1～3)。
7、本专利技术还提供了nk细胞的基因编辑方法，是以crispr/cas12a系统对nk细胞的目标位点进行敲除，所述目标位点为tigit基因，所述基因编辑方法包括治疗目的和非治疗目的。
8、在一些实施方案中，所述crispr/c本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种NK细胞，其特征在于，所述NK细胞为TIGIT基因被敲除和/或其表达受到抑制的NK细胞。
2.根据权利要求1所述的NK细胞，其特征在于，所述TIGIT基因的表达通过CRISPR/Cas12a技术被敲除。
3.根据权利要求1或2所述的NK细胞，其特征在于，所述NK细胞是以RNP复合物对目标位点的表达进行敲除后的NK细胞，所述目标位点为TIGIT基因，所述RNP复合物包括Cas12a蛋白和sgRNA，所述sgRNA的序列选自由SEQ ID No.1、SEQ ID No.2或SEQ ID No.3所示序列中的至少一者。
4.一种如权利要求1或2所述的NK细胞的基因编辑方法，其特征在于，以CRISPR/Cas12a系统对NK细胞的目标位点进行敲除，所述目标位点为TIGIT基因，所述基因编辑方法是非治疗目的。
5.根据权利要求4所述的基因编辑方法，其特征在于，所述CRISPR/Cas12a系统包括含有Cas12a蛋白和sgRNA组成的RNP复合物。
6.根据权利要求5所述的基因编辑方法，其特征在于，所述sgRNA的序列选自
7.一种权利要求1或2所述的NK细胞的制备方法，其特征在于，包括：获取RNP复合物；将所述RNP复合物通过电穿孔转染NK细胞；分选获得目标细胞。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述RNP复合物包括Cas12a蛋白和sgRNA，所述sgRNA的序列选自由SEQ ID No.1、SEQ ID No.2和SEQ ID No.3所示序列组成的组中的至少一者。
9.包含NK细胞的免疫治疗产品，其特征在于，包含如权利要求1或2所述的NK细胞。
10.一种如权利要求9所述的免疫治疗产品在制备用于抑制肿瘤细胞增殖的试剂盒中的用途，所述试剂盒包括权利要求9所述的免疫治疗产品。
...【技术特征摘要】
1.一种nk细胞，其特征在于，所述nk细胞为tigit基因被敲除和/或其表达受到抑制的nk细胞。
2.根据权利要求1所述的nk细胞，其特征在于，所述tigit基因的表达通过crispr/cas12a技术被敲除。
3.根据权利要求1或2所述的nk细胞，其特征在于，所述nk细胞是以rnp复合物对目标位点的表达进行敲除后的nk细胞，所述目标位点为tigit基因，所述rnp复合物包括cas12a蛋白和sgrna，所述sgrna的序列选自由seq id no.1、seq id no.2或seq id no.3所示序列中的至少一者。
4.一种如权利要求1或2所述的nk细胞的基因编辑方法，其特征在于，以crispr/cas12a系统对nk细胞的目标位点进行敲除，所述目标位点为tigit基因，所述基因编辑方法是非治疗目的。
5.根据权利要求4所述的基因编辑方法，其特征在于，所述crispr/cas12a系统包括含有ca...
【专利技术属性】
技术研发人员：卢社莲，唐立春，李营营，全壮，
申请(专利权)人：北京鼎成肽源生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：
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