重组免疫检查点受体及免疫检查点抑制分子的共表达及应用制造技术

本发明专利技术提出了一种转基因淋巴细胞、一种构建体和一种治疗癌症的治疗组合物，该转基因淋巴细胞的细胞免疫检查点被沉默以及表达重组受体，该重组受体包括：细胞免疫检查点分子片段；免疫刺激分子片段；以及T细胞受体zeta链。该转基因淋巴细胞具有抵抗肿瘤细胞介导的免疫抑制的特性，对肿瘤细胞的杀伤能力显著增强。

Co expression and application of recombinant immunologic checkpoint receptor and immunologic checkpoint suppressor

The present invention relates to transgenic lymphocytes, a body and a cancer treatment construction composition, cell immune checkpoint of the transgenic lymphocytes by silencing and expression of recombinant receptors, including the recombinant receptor: cell immune checkpoint molecule fragment; costimulatory molecules and fragments; T cell receptor zeta chain. The transgenic lymphocyte, which is resistant to tumor cell mediated immunity, significantly increases the killing ability of the tumor cells.

【技术实现步骤摘要】
重组免疫检查点受体及免疫检查点抑制分子的共表达及应用
本专利技术涉及生物医药领域，具体地，本专利技术涉及重组免疫检查点受体及免疫检查点抑制分子的共表达及应用，更具体地，本专利技术涉及重组受体、核酸、慢病毒、转基因淋巴细胞、构建体、制备转基因淋巴细胞的方法、治疗癌症的治疗组合物以及提高淋巴细胞免疫杀伤能力的方法。
技术介绍
癌症，由于细胞内基因突变导致细胞增殖失控的一种疾病。目前已成为人类健康的重大威胁，是导致人类死亡的主要原因之一。世界卫生组织(WHO)在发表的《全球癌症报告2014》中指出，2012年全球癌症患者和死亡病例都在迅速增加，而新增癌症病例有近一半出现在亚洲，其中大部分在中国，中国新增癌症病例高居第一位。《2012年中国肿瘤登记年报》数据显示，中国每年新增癌症病例约350万，约有250万人因此死亡。因此，寻找高效特异的癌症治疗方法具有重大的临床价值。传统的肿瘤治疗方法主要包括手术、放疗和化疗，但这几种方法都具有较大的局限性，比如由于癌细胞的近端入侵或远端转移，手术切除后的肿瘤转移复发率较高，而放疗和化疗对于机体自身的正常细胞尤其是造血系统和免疫系统会造成严重的损害，因此对于已发生肿瘤转移的患者也很难达到较好的远期疗效。随着肿瘤分子机制的深入研究和生物技术的进一步发展，靶向药物治疗和免疫治疗在肿瘤的综合治疗中发挥着愈来愈大的作用。靶向疗法主要包括单克隆抗体(有时归为被动胞回输和肿瘤疫苗等。免疫疗法通过调动机体的免疫系统，增强肿瘤微环境抗肿瘤免免疫疗法)和小分子靶向药物，而免疫疗法主要包括细胞因子疗法、免疫检验点单抗、过继免疫疗法，从而控制和杀伤肿瘤细胞，因此有效率高，特异性强，耐受性好的优点，在肿瘤治疗中具有广阔的前景。然而，肿瘤的免疫疗法，仍有待进一步深入研究和开发，来增强临床疗效。
技术实现思路
本专利技术旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。为此，本专利技术的一个目的在于提出一种重组受体及利用其有效增强淋巴细胞免疫杀伤肿瘤细胞的方法。在本专利技术的第一方面，本专利技术提出了一种重组受体。根据本专利技术的实施例，所述重组受体包括：细胞免疫检查点分子片段；免疫刺激分子片段；以及T细胞受体zeta链。根据本专利技术的实施例，使淋巴细胞表达本专利技术实施例的重组受体，可有效增强淋巴细胞对肿瘤细胞的特异性杀伤效果。根据本专利技术的实施例，上述重组受体还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：根据本专利技术的实施例，所述细胞免疫检查点分子为PD1。PD1可与肿瘤细胞上特异性表达的PD-L1或PD-L2相结合。进而，淋巴细胞表达本专利技术实施例的重组受体，其对肿瘤细胞，尤其是PD-L1或PD-L2阳性肿瘤细胞的靶向杀伤性进一步增强。根据本专利技术的实施例，所述细胞免疫检查点分子片段包括所述PD1的胞外区以及任选的跨膜区，所述免疫刺激分子片段包括CD28的胞内区以及任选的跨膜区。PD1的胞外区具有与肿瘤细胞上特异性表达的PD-L1或PD-L2相结合的功能区，CD28的胞内区具有激活免疫刺激信号通路的功能区，进而淋巴细胞细胞表达本专利技术实施例的重组受体，其对肿瘤细胞的靶向性杀伤效果进一步提高。根据本专利技术的实施例，所述重组受体包括：(a)所述PD1的胞外区和跨膜区；以及(b)所述CD28的胞内区，或者包括：(i)所述PD1的胞外区；以及(ii)所述CD28的胞内区和跨膜区。这两种组合方式均保留了PD1与肿瘤细胞上特异性表达的PD-L1或PD-L2相结合的功能区以及CD28激活免疫刺激信号通路的功能区，同时不论是PD1跨膜区还是CD28的跨膜区，均可使重组受体跨膜表达，进而淋巴细胞细胞表达本专利技术实施例的重组受体，其对肿瘤细胞的靶向性杀伤效果进一步提高。根据本专利技术的实施例，所述T细胞受体zeta链为CD3zeta链。CD3zeta链可特异性激活下游T细胞受体信号通路，进而淋巴细胞细胞表达本专利技术实施例的重组受体，其对肿瘤细胞的杀伤效果进一步提高。根据本专利技术的实施例，所述细胞免疫检查点分子片段的C端与所述免疫刺激分子片段的N端相连，所述免疫刺激分子片段的C端与所述T细胞受体zeta链的N端相连。本专利技术实施例的重组受体的相关片段在上述连接顺序下，有利于相关片段在细胞中的定位，进而更有利于发挥相应的功能-靶向、跨膜、激活免疫刺激信号通路以及激活T细胞受体信号通路，其对肿瘤细胞的靶向性杀伤能力进一步提高。在本专利技术的第二方面，本专利技术提出了一种重组受体。根据本专利技术的实施例，所述重组受体具有SEQIDNO：1或2所示的氨基酸序列。MQIPQAPWPVVWAVLQLGWRPGWFLDSPDRPWNPPTFSPALLVVTEGDNATFTCSFSNTSESFVLNWYRMSPSNQTDKLAAFPEDRSQPGQDCRFRVTQLPNGRDFHMSVVRARRNDSGTYLCGAISLAPKAQIKESLRAELRVTERRAEVPTAHPSPSPRPAGQFQTLVVGVVGGLLGSLVLLVWVLAVISKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR(SEQIDNO：1)。MQIPQAPWPVVWAVLQLGWRPGWFLDSPDRPWNPPTFSPALLVVTEGDNATFTCSFSNTSESFVLNWYRMSPSNQTDKLAAFPEDRSQPGQDCRFRVTQLPNGRDFHMSVVRARRNDSGTYLCGAISLAPKAQIKESLRAELRVTERRAEVPTAHPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR(SEQIDNO：2)。根据本专利技术的实施例，使淋巴细胞表达本专利技术实施例的重组受体，可有效增强淋巴细胞对肿瘤细胞，特别是PD-L1或PD-L2阳性肿瘤细胞的特异性杀伤效果。在本专利技术的第三方面，本专利技术提出了一种核酸。根据本专利技术的实施例，所述核酸编码前面所述的重组受体，任选地，所述核酸具有SEQIDNO：3或4所示的核苷酸序列。ATGCAGATCCCACAGGCGCCCTGGCCAGTCGTCTGGGCGGTGCTACAACTGGGCTGGCGGCCAGGATGGTTCTTAGACTCCCCAGACAGGCCCTGGAACCCCCCCACCTTCTCCCCAGCCCTGCTCGTGGTGACCGAAGGGGACAACGCCACCTTCACCTGCAGCTTCTCCAACACATCGGAGAGCTTCGTGCTAAACTGGTACCGCATGAGCCCCAGCAACCAGACGGACAAGCTGGCCGCCTTCCCCGAGGACCGCAGCCAGCCCGGCCAGG本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种重组受体，其特征在于，包括：细胞免疫检查点分子片段；免疫刺激分子片段；以及T细胞受体zeta链。

【技术特征摘要】
1.一种重组受体，其特征在于，包括：细胞免疫检查点分子片段；免疫刺激分子片段；以及T细胞受体zeta链。2.根据权利要求1所述的重组受体，其特征在于，所述细胞免疫检查点分子为PD1。3.根据权利要求2所述的重组受体，其特征在于，所述细胞免疫检查点分子片段包括PD1的胞外区以及任选的跨膜区，所述免疫刺激分子片段包括CD28的胞内区以及任选的跨膜区。4.根据权利要求3所述的重组受体，其特征在于，包括：(a)所述PD1的胞外区和跨膜区；以及(b)所述CD28的胞内区，或者包括：(i)所述PD1的胞外区；以及(ii)所述CD28的胞内区和跨膜区。5.根据权利要求1所述的重组受体，其特征在于，所述T细胞受体zeta链为CD3zeta链。6.根据权利要求1所述的重组受体，其特征在于，所述细胞免疫检查点分子片段的C端与所述免疫刺激分子片段的N端相连，所述免疫刺激分子片段的C端与所述T细胞受体zeta链的N端相连。7.一种重组受体，其特征在于，所述重组受体具有SEQIDNO：1或2所示的氨基酸序列。8.一种核酸，其特征在于，所述核酸编码权利要求1～7任一项所述的重组受体，任选地，所述核酸具有SEQIDNO：3或4所示的核苷酸序列。9.一种慢病毒，其特征在于，所述慢病毒携带下列核酸分子：(a)编码权利要求1～7任一项所述重组受体的核酸分子，所述重组受体具有SEQIDNO：1或2所示的氨基酸序列，所述编码重组受体的核酸分子具有SEQIDNO：3或4所示的核苷酸序列；(b)沉默细胞免疫检查点的核酸分子，所述沉默细胞免疫检查点的核酸分子的核苷酸序列为选自SEQIDNO：5～137的至少之一；任选地，进一步携带编码无功能EGFR的核酸分子，所述无功能EGFR具有SEQIDNO：138所示的氨基酸序列，所述编码无功能EGFR的核酸分子具有SEQIDNO：139所示的核苷酸序列。10.一种慢病毒，其特征在于，所述慢病毒携带含有SEQIDNO：140～155所示的核苷酸序列。11.一种转基因淋巴细胞，其特征在于，所述转基因淋巴细胞的细胞免疫检查点被沉默，并且所述转基因淋巴细胞表达权利要求1～7任一项所述的重组受体，任选地，所述转基因淋巴细胞进一步表达无功能EGFR。12.根据权利要求11所述的转基因淋巴细胞，其特征在于，所述淋巴细胞细胞免疫检查点独立地选自CTLA4、PD1、TIM3、BTLA、LAG-3、IRAK-M、SOCS1、A20、CBL-B的至少之一；优选地，所述淋巴细胞细胞免疫检查点为CTLA4、PD1、SOCS1或CBL-B。13.根据权利要求12所述的转基因淋巴细胞，其特征在于，所述淋巴细胞细胞免疫检查点被沉默是通过shRNA、反义核酸、核酶、显性负突变、CRISPR-Cas9，CRISPR-Cpf1，和锌指核酸酶至少之一实现的。14.根据权利要求13所述的转基因淋巴细胞，其特征在于，所述淋巴细胞细胞免疫检查点被沉默是通过shRNA实现的。15.根据权利要求11所述的转基因淋巴细胞，其特征在于，所述淋巴细胞是抗原特异性T淋巴细胞，任选地，所述淋巴细胞是肿瘤浸润T淋巴细胞，...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈思毅，
申请(专利权)人：生命序有限公司，
类型：发明
国别省市：伯利兹,BZ