溶瘤病毒构建体、溶瘤病毒及其应用制造技术

本发明专利技术提出了溶瘤病毒构建体、溶瘤病毒及其应用。溶瘤病毒构建体包含：第一核酸分子，所述第一核酸分子编码分泌型融合蛋白分子，所述分泌型融合蛋白分子用于抑制免疫检查点；以及第二核酸分子，所述第二核酸分子编码免疫刺激分子。根据本发明专利技术实施例的构建体编码抑制免疫检查点的融合蛋白和免疫刺激分子，能够抑制免疫检查点分子所介导的免疫抑制机制和引起个体肿瘤特异性的免疫反应，进而实现全身性的，有效的杀伤肿瘤细胞。

【技术实现步骤摘要】
溶瘤病毒构建体、溶瘤病毒及其应用
本专利技术涉及生物医药领域，具体地，本专利技术涉及溶瘤病毒构建体、溶瘤病毒、重组细胞、药物组合物，更进一步地，本专利技术涉及溶瘤病毒构建体、溶瘤病毒、重组细胞在制备药物中的用途，所述药物用于治疗或预防癌症、抑制哺乳动物恶性细胞增殖。
技术介绍
溶瘤病毒是指一类具有在肿瘤细胞中选择性复制与包装能力，实现选择性杀伤肿瘤细胞的病毒。目前，多数研究通过改造一些自然界存在的致病力较弱的毒种，使其特异的在肿瘤细胞中表达包装继而实现溶瘤作用。溶瘤病毒实现选择性杀伤肿瘤细胞的原理主要有两种：第一，利用靶细胞中抑癌基因的失活或缺陷从而选择性地感染肿瘤细胞；第二，选择利用肿瘤特异性的启动子调控病毒关键基因的表达使溶瘤病毒在肿瘤细胞内大量复制并表达毒性蛋白摧毁肿瘤细胞，并/或同时分泌细胞因子刺激自身免疫系统攻击肿瘤细胞。相应的溶瘤病毒无法或减低在正常机体细胞内复制而不具有或减弱杀伤作用，因此溶瘤病毒具有高的抗肿瘤效应和低的副作用。近几十年来，溶瘤病毒治疗引起了广泛关注，相关研究取得了进展。目前腺病毒(adenovirus)、单纯疱疹病毒-1(herpessimplexvirus-1，HSV-1)、新城疫病毒等相继被改造成溶瘤病毒。2006年，溶瘤腺病毒产品(oncorine)在中国已经用于临床治疗，主要用于治疗鼻咽癌等。Oncorine的原理，将人5型腺病毒E1B-55kD区删除，使该病毒可在p53基因突变的癌细胞中繁殖并杀伤宿主细胞，产生溶瘤治疗作用。但是，临床数据显示这种基于p53基因突变的溶瘤腺病毒的治疗效果并不十分理想。美国生物治疗公司Jennerex的JX-594是一种经过修改的牛痘病毒。在2013年完成的二期临床试验中，发现原发性肝癌患者在注射了高剂量的病毒后，其生命延长时间的中间值可达到14.1个月，而接受低剂量注射的患者只有6.7个月的生命延长期。生物技术公司BioVex研发的基因工程化的单纯疱疹病毒OncoVEXGM-CSF已于2015年10月通过了FDA的批准成为世界首个上市的溶瘤病毒产品。OncoVex可选择性地杀灭肿瘤细胞同时表达分泌GM-CSF启动机体产生系统的免疫反应杀伤剩余局部肿瘤细胞及其转移肿瘤。2009年BioVex公布的一项转移性黑色素瘤II期试验的结果显示50名患者中有26％对治疗有反应，有8名患者完全恢复健康。该公司于2011年被Amgen公司收购，用于推进三期临床试验。2013年3月，安进(Amgen)公布了OncoVex的治疗数据，临床证明它能成功地让晚期患者的肿瘤缩小，并在超过400名试验患者的III期研究中，Amgen的该药物要比同类其他药物表现得更加出色。综合以上的研究成果可以发现，溶瘤病毒确实是治疗肿瘤的利器，但溶瘤病毒依然需要科研工作者进一步地开发和改进，来增强局部及全身性抗肿瘤作用。
技术实现思路
本专利技术旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。为此，本专利技术提出一种溶瘤病毒，该溶瘤病毒能够在肿瘤细胞内大量复制并最终摧毁肿瘤细胞，同时它还能激发免疫反应，吸引及激活更多免疫细胞来继续杀伤局部残余癌细胞及全身转移扩散的癌细胞。在本专利技术的第一方面，本专利技术提出了一种溶瘤病毒构建体。根据本专利技术的实施例，所述溶瘤病毒构建体包含：第一核酸分子，所述第一核酸分子编码分泌型融合蛋白分子，所述分泌型融合蛋白分子用于特异性抑制免疫检查点分子；以及第二核酸分子，所述第二核酸分子编码免疫刺激分子。根据本专利技术实施例的构建体编码抑制免疫检查点的融合蛋白和免疫刺激分子，能够抑制免疫检查点分子所介导的免疫抑制机制和引起个体肿瘤特异性的免疫反应，进而实现全身性的，有效的杀伤肿瘤细胞。根据本专利技术的实施例，上述溶瘤病毒构建体还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：根据本专利技术的实施例，所述分泌型融合蛋白用于特异性抑制PD-L1，所述分泌型融合蛋白分子为分泌型PD1融合蛋白或CD80融合蛋白。分泌型PD1融合蛋白或CD80融合蛋白可与肿瘤细胞表面的PD-L1结合，而抑制PD-L1介导的免疫抑制机制，进而肿瘤细胞的免疫逃逸机制被封闭，免疫细胞能够有效杀伤肿瘤细胞。根据本专利技术的实施例，所述分泌型融合蛋白用于特异性抑制PD-1，所述分泌型融合蛋白分子为分泌型PD-L2融合蛋白。分泌型PD-L2融合蛋白可与免疫细胞表面的PD-1结合，而抑制PD-1介导的免疫抑制机制，进而肿瘤细胞的免疫逃逸机制被封闭，免疫细胞能够有效杀伤肿瘤细胞。根据本专利技术的实施例，所述分泌型PD1融合蛋白包括PD1信号肽段、PD1胞外区段和IgGFc段。信号肽是合成融合蛋白的N末端的一段短肽，其作用是介导融合蛋白分泌出细胞。程序性死亡因子-1(PD-1)也可被叫做程序性细胞死亡因子1(PDCD1)或CD279，是一种免疫球蛋白超家族的单通I型跨膜糖蛋白。它是CD28/CTLA-4家族中的一种免疫受体，具有lgV型胞外区，其胞外区与CTLA-4，CD28和ICOS有21％～33％序列一致。PD-1的胞浆部包含两个酪氨酸残基，一个是基于近膜免疫受体酪氨酸的抑制功能区(ITIM)，另一个是基于免疫受体酪氨酸的转换功能区(ITSM)。ITIM广泛存在于免疫抑制受体中，并且近膜酪氨酸残基对于PD-1的抑制功能可能起着关键作用。PD-1表达在激活的T细胞，B细胞和巨噬细胞的表面，PD-1与CTLA-4相比，PD-1更加广泛地负向调控免疫反应。PD-1与PD-L1或PD-L2结合，进而启动蛋白酪氨酸磷酸化来负向调控抗原受体的信号转导。PD-1参与到淋巴细胞的克隆选择和外周耐受的生理过程，从而可预防自体免疫疾病。作为一个T-细胞效应机制的负向调控器，PD-1与表达在肿瘤细胞上的PD-L1相互作用，导致抗肿瘤免疫的抑制。可溶性PD1胞外IgV区片段能够与表达在肿瘤细胞表面的PD-L1结合，因此竞争性抑制了表达在T细胞的PD1与表达在肿瘤细胞上的PD-L1的相互作用。与免疫球蛋白Fc构建的治疗性融合蛋白对于通过二聚作用改进生物活性，以及通过增加分子大小和减少降解，来增加在血浆的半衰期。例如改进型Fc融合蛋白包括etanercept，belatacept和romiplostim，这三种蛋白分别由Fc区融合肿瘤坏死因子受体2，CTLA-4的胞外区和TPO-模拟肽组成。根据本专利技术的实施例，所述CD80融合蛋白包括CD80信号肽段、CD80胞外区段和IgGFc段。一些研究表明，CD80与PD-L1结合，其结合亲和力与CD80与CD28的结合亲和力大致相当，这表明CD80能够与PD-L1结合并且通过空间位阻效应阻止PD-1-PD-L1的相互作用。在人类以及小鼠肿瘤细胞上的研究也表明，由胞外CD80lgV和lgC区融合IgGFc段的可溶性CD80-Fc融合蛋白可抑制PD-1与PD-L1+肿瘤细胞结合，并激活PD-1+CD4+和CD8+T细胞。根据本专利技术的实施例，所述分泌型PD-L2融合蛋白包括PD-L2信号肽段、PD-L2胞外区段和IgGFc段。PD-L2和PD-L1均能结合PD1。可溶性PD-L2-Fc融合蛋白能够与PD1结合并激活T细胞来杀伤肿瘤细胞。根据本专利技术的实施例，所述免疫刺激分子包括选自人类GM-CSF、IL-2，IL-12，IL本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种溶瘤病毒构建体，其特征在于，包含：第一核酸分子，所述第一核酸分子编码分泌型融合蛋白分子，所述分泌型融合蛋白分子用于特异性抑制免疫检查点分子；以及第二核酸分子，所述第二核酸分子编码免疫刺激分子。

【技术特征摘要】
1.一种溶瘤病毒构建体，其特征在于，包含：第一核酸分子，所述第一核酸分子编码分泌型融合蛋白分子，所述分泌型融合蛋白分子用于特异性抑制免疫检查点分子；以及第二核酸分子，所述第二核酸分子编码免疫刺激分子。2.根据权利要求1所述的溶瘤病毒构建体，其特征在于，所述分泌型融合蛋白用于特异性抑制PD-L1，所述分泌型融合蛋白分子为分泌型PD1融合蛋白或CD80融合蛋白。3.根据权利要求1所述的溶瘤病毒构建体，其特征在于，所述分泌型融合蛋白用于特异性抑制PD-1，所述分泌型融合蛋白分子为分泌型PD-L2融合蛋白。4.根据权利要求2所述的溶瘤病毒构建体，其特征在于，所述分泌型PD1融合蛋白包括PD1信号肽段、PD1胞外区段和IgGFc段。5.根据权利要求2所述的溶瘤病毒构建体，其特征在于，所述CD80融合蛋白包括CD80信号肽段、CD80胞外区段和IgGFc段。6.根据权利要求3所述的溶瘤病毒构建体，其特征在于，所述分泌型PD-L2融合蛋白包括PD-L2信号肽段、PD-L2胞外区段和IgGFc段。7.根据权利要求1所述的溶瘤病毒构建体，其特征在于，所述免疫刺激分子包括选自人类GM-CSF、IL-2，IL-12，IL-15，IL-18，IL-24，TNF，IFNα，IFNβ，IFNγ，MIP-I，MIP-Iβ，MCP-I，RANTES的至少之一。8.根据权利要求1所述的溶瘤病毒构建体，其特征在于，所述构建体为牛痘病毒，所述牛痘病毒为WR株牛痘病毒，所述牛痘病毒中的胸苷激酶基因和生长因子基因失活。9.根据权利要求8所述的溶瘤病毒构建体，其特征在于，所述第一核酸分子以及第二核酸分子设置于所述胸苷激酶基因的第240碱基之后，第308碱基之前。10.根据权利要求1所述的溶瘤病毒构建体，其特征在于，...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄雪芬，陈思毅，
申请(专利权)人：生命序有限公司，
类型：发明
国别省市：伯利兹,BZ