本发明专利技术利用酵母内质网滞留筛选系统(YESS)快速解析蛋白酶底物切割位点特异性，最终提供了一种切割效率增强的HRV 3C蛋白酶底物序列突变体及其应用。该底物变体包含序列表中SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列，其在蛋白纯化过程中移除纯化标签中具有较好的实际应用优势，从而有利于HRV 3C蛋白酶的进一步应用和研究。
【技术实现步骤摘要】
一种切割效率增强的HRV3C蛋白酶底物突变体及其应用
本专利技术属于生物工程
，具体而言，涉及一种切割效率增强的HRV3C蛋白酶底物序列突变体及其应用。
技术介绍
人鼻病毒(HRV)是单股正链小RNA病毒，其编码的3C蛋白酶属于半胱氨酸蛋白酶家族，可以识别多肽序列LEVLFQ↓GP，并在Gln和Gly之间进行切割。HRV3C蛋白酶具有特异性强，酶活高等特性，即使在4℃低温条件下依然有较高的酶活。目前，HRV3C蛋白酶已广泛商品化，特别是用来在蛋白纯化过程中移除纯化标签。然而，作为一种高价值的商业酶，HRV3C蛋白酶的底物特异性还没有相关报道。另外，蛋白酶底物切割位点特异性的研究是全面了解和应用蛋白酶的一个必要的过程，而传统的研究方法是定点突变后，表达、纯化得到相应底物突变体，然后进行体外反应，检测、定量分析。该方法工作量大，操作复杂，效率低，操作误差大，不利于实验的高效开展，因此很难筛选得到切割效率增强的HRV3C蛋白酶底物序列突变体。
技术实现思路
鉴于现有技术的不足，本专利技术开发了一种利用酵母内质网滞留筛选系统(YESS)来快速解析蛋白酶底物切割位点特异性的新方法--YESS-PSSC。酵母内质网滞留信号肽(ERS,ERsequestrationsignal)是存在于蛋白羧基端的一段6个氨基酸长度的多肽(FEHDEL)，它可以与内质网内膜上的蛋白相互作用，使携带滞留信号肽的蛋白往返穿梭于内质网与高尔基体中以延长蛋白在内质网与高尔基体中的滞留时间，增加酶动力学范围。Aga2为酿酒酵母表面的α凝集素成分，外源蛋白可借助与Aga2的融合表达而在酵母细胞表面被展示；所使用的荧光标签分别是FLAG和HA，对应的氨基酸序列分别是DYKDDDDK和YPYDVPDYA，当各自对应的荧光抗体Anti-FLAG-APC和Anti-HA-FITC与之相结合时，根据底物的不同切割情况，可通过流式细胞仪检测到相应的荧光信号。在带内质网滞留信号肽和不带内质网滞留信号肽两种情况下，都得到HRV3C-P底物P1、P1’、P2’3个位点各3种突变体底物。其中，特异性最高的P1位点包括氨基酸为Q、N、F的3种底物，特异性较高的P1’位点包括氨基酸为G、A、D的3种底物，特异性较低的P2’位点包括氨基酸为P、F、W的3种底物,然后让酶和底物复合体在内质网中发生反应，不同切割情况的底物会展示在细胞表面。当专利技术人用对应的荧光抗体Anti-FLAG-APC和Anti-HA-FITC孵育细胞时，不被切割的底物复合体可以同时被两种荧光抗体Anti-FLAG-APC和Anti-HA-FITC标记；而被切割的底物复合体只能被荧光抗体Anti-FLAG-APC标记。所以，根据细胞表面展示底物的不同切割情况，流式细胞仪可以检测到不同的信号，取一定量的细胞分析即可得到该底物突变体的切割效率。即说明可以利用酵母内质网滞留筛选系统(YESS)来解析蛋白酶底物切割位点特异性。结果表明：对于特异性高的P1和P1’位点底物突变体，展示时，酶和底物端都需要加内质网滞留信号肽(FEHDEL)；对于特异性低的P2’位点底物突变体展示时，酶和底物端都不需要加内质网滞留信号肽；则可以通过酵母内质网滞留信号肽的不同应用来解析HRV3C蛋白酶针对其底物切割位点P1(Q),P1’(G),P2’(P)的特异性(参见图2)。因此，本专利技术利用酵母内质网滞留筛选系统(YESS)快速解析蛋白酶底物切割位点特异性，最终提供了一种切割效率增强的HRV3C蛋白酶底物序列突变体及其应用，具体的技术方案概况如下：本专利技术提供一种HRV3C蛋白酶底物变体，其包含序列表中SEQIDNO.1所示的氨基酸序列。进一步优选地，所述HRV3C蛋白酶底物变体，其为序列表中SEQIDNO.1所示的氨基酸序列。在本专利技术的一个具体的实施例中，上述的HRV3C蛋白酶底物变体，其为MBP-Substrare-6xHis-GST，其中Substrare为序列表中SEQIDNO.1所示的氨基酸序列。另一方面，本专利技术还可以提供编码上述HRV3C蛋白酶底物变体的核苷酸序列；以及含有该核苷酸序列的重组表达载体。另一方面，本专利技术还可以提供一种遗传工程化的宿主细胞，所述的细胞含有上述的重组表达载体。进一步优选地，所述的宿主细胞为大肠杆菌。最后一方面，本专利技术还可以提供上述HRV3C蛋白酶底物变体在蛋白纯化过程中移除纯化标签中的应用。与现有技术相比，本专利技术具有如下优点和显著进步：(1)为了解析HRV3C蛋白酶底物切割位点P1(Q),P1’(G),P2’(P)特异性，专利技术人对HRV3C蛋白酶底物切割位点P1(Q),P1’(G),P2’(P)分别进行饱和突变，然后利用酵母内质网滞留筛选系统(YESS)来解析蛋白酶底物切割位点特异性。我们的研究表明，HRV3C蛋白酶在P1和P1’位点分别偏好Gln和Gly，然而在P2’位点相对原始的Pro氨基酸，更偏好Met。YESS-PSSC对HRV3C-P底物特异性的成功解析，证明了该方法广泛用于快速解析蛋白酶底物特异性的可行性和优越性；并找到了一种切割效率优于原始HRV3C-P的底物序列的新底物序列-LEVLFQ↓GM。新底物序列-LEVLFQ↓GM-切割效率高，且切割残基中的Met可以作为蛋白质的第一个氨基酸，即只有一个Gly残留，对一些药用蛋白在去除融合标签后的应用中，引起免疫反应的可能更低。所以，底物序列LEVLFQGM作为HRV3C-P的新型底物具有更高的价值。(2)针对特异性高的P1和P1’位点底物突变体(LEVLFXGP和LEVLFQXP)，试验中需要一个高效的反应体系，因此酶和底物复合体形式分别为HRV3C-ERS和Aga2-FLAG-Substrare-HA-ERS；但对于特异性低的P2’位点底物突变体(LEVLFQGX)，只有在一个低效的反应体系中才能呈现不同突变体的差异，即酶和底物复合体形式为HRV3C和Aga2-FLAG-Substrare-HA。本专利技术通过酵母内质网滞留信号肽的不同应用扩展了这一方法的动力学范围，快速、准确的解析了HRV3C蛋白酶针对其底物切割位点P1(Q),P1’(G),P2’(P)的特异性，在开发了一种简单易行的方法的同时，发现了一种HRV3C蛋白酶可以更高效切割的底物，从而有利于HRV3C蛋白酶的进一步应用和研究。(3)本专利技术获得的HRV3C蛋白酶底物突变体序列LEVLFQGM在实际应用中具有更为高效的切割优势。将含有HRV3C蛋白酶与底物编码序列的质粒转化到大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)感受态细胞中，诱导蛋白表达后纯化，并用SDS-PAGE检测纯化结果。HRV3C蛋白酶的底物由融合蛋白MBP和GST融合表达，其中MBP大小为42kDa，GST大小为26kDa，底物融合蛋白MBP-LEVLFQGP/M-6xHis-GST在70kDa左右。纯化得到的HRV3C蛋白酶和底物融合蛋白按照摩尔比为1:10比例混合，分别在4℃、16℃、22℃、30℃反应，SDS-PAGE检测酶切结果。从图4可知，HRV3C蛋白酶可以高效切割MBP-LEVLFQGP/M-6xHis-GST融合蛋白，将底物融合蛋白切割成42kDa的MBP和26kDa的GST，而且切割底物LEVL本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种HRV 3C蛋白酶底物变体，其包含序列表中SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。
【技术特征摘要】
1.一种HRV3C蛋白酶底物变体，其包含序列表中SEQIDNO.1所示的氨基酸序列。2.根据权利要求1所述HRV3C蛋白酶底物变体，其为序列表中SEQIDNO.1所示的氨基酸序列。3.根据权利要求1所述HRV3C蛋白酶底物变体，其为MBP-Substrare-6xHis-GST，其中Substrare为序列表中SEQIDNO.1所示的氨基酸序列。4....
【专利技术属性】
技术研发人员：易犁，范贤，彭文舫，周瑜，喻婵，张桂敏，
申请(专利权)人：湖北大学，
类型：发明
国别省市：湖北,42
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