【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及黄曲霉毒素b1检测，尤其涉及一种电化学发光检测afb1探针的制备方法、电化学发光检测afb1的试纸条以及afb1检测方法。
技术介绍
1、黄曲霉毒素b1(aflatoxin b1，afb1)是黄曲霉等特定真菌菌株所产生的一类含有双呋喃环和氧杂萘邻酮结构的次生代谢产物。1993年，afb1被国际癌症研究机构(iarc)列为ⅰ类化学致癌物，在极低含量下即对人和动物具有强烈的致癌性、致畸性、致突变性、抑制免疫力和肝损伤等毒性作用，发展高灵敏的afb1快速检测技术是很有必要的。传统侧流层析免疫试纸条(lfi)采用比色或荧光标记抗原或抗体，通过观察检测线上的颜色变化，从而实现快速测定。该方法具有装置便携、操作简单、耗时短、成本低等优点，已被广泛应用于医学诊断和食品安全风险评估。然而，对于超痕量afb1监测，该方法仍存在检测灵敏度不足、难以避免假阳/阴性等问题。
2、目前，为提高传统试纸条的灵敏度，已开始基于试纸条进行各种技术耦合的研究，以建立多功能试纸条实现真菌毒素的定量检测。现有的lfi基联用技术，包括，lfi-荧光法(flfi)联用技术、lfi-化学发光法(cllfi)联用技术、lfi-拉曼散射传感法(slfi)联用技术、lfi-电化学(elfi)联用技术等。虽然这些联用技术在一定程度上有效地提高了检测灵敏度，但仍存在背景光干扰(自身荧光和散射光)或环境稳定性不佳等问题。
3、基于目前afb1快检技术存在的缺陷，有必要对此进行改进。
技术实现思路
1
2、第一方面，本专利技术提供了一种电化学检测afb1探针的制备方法，包括以下步骤：
3、将[ru(dcbpy)3]2+和pei溶液作为前驱体，反应得到ru-pei配合物；
4、将ru-pei配合物、水、氨水、乙醇混合后，搅拌，再加入teos，于黑暗下搅拌反应，得到ru-pei@sio2溶液；
5、将含金化合物加入至ru-pei@sio2溶液，于50～70℃下搅拌，再加入柠檬酸钠，继续搅拌，离心洗涤后分散至水中，得到ru-pei@sio2@au；
6、将ru-pei@sio2@au与afb1抗体混合，得到混合溶液；
7、将混合溶液于20～25℃下孵育1.5～3h，然后加入bsa溶液，继续孵育20～40min，收集得到anti-afb1-ru-pei@sio2@au共轭物，重悬于tris-hcl中，即得电化学发光检测afb1探针。
8、优选的，[ru(dcbpy)3]2+溶液与edc/nhs混合溶液混合搅拌需20～40min，制备ru-pei配合物需在2～6℃下反应4～8h；
9、优选的，[ru(dcbpy)3]2+溶液浓度为0.005～0.02m，pei溶液浓度为15～25mg/ml，edc/nhs混合溶液中edc浓度为0.001～0.003m、nhs浓度为0.004～0.012m。
10、优选的，ru-pei配合物、水、氨水、乙醇混合后需搅拌10～30min，加入teos后需在20～25℃黑暗下搅拌反应10～15h，氨水的质量浓度为25～28％。
11、优选的，含金化合物包括haucl4、kaucl4、naaucl4中的至少一种，含金化合物溶液加入至ru-pei@sio2溶液后需于50～70℃下搅拌，离心速率为8000～12000r/min含金化合物溶液质量浓度为5～15％，柠檬酸钠溶液质量浓度为0.5～2％。
12、优选的，ru-pei@sio2@au与afb1抗体混合溶液中afb1抗体浓度为0.05～0.2mg/ml，bsa溶液的质量浓度为5～20％，anti-afb1-ru-pei@sio2@au共轭物重悬于tris-hcl中使用的tris-hcl浓度为0.05～0.2m，体积为1～3ml。
13、第二方面，本专利技术还提供了一种电化学发光检测afb1的试纸条，包括：
14、基板，其表面设有工作电极、参比电极和对电极；
15、nc膜，所述nc膜表面分别喷涂有afb1-bsa、羊抗鼠igg以形成测试线和质控线；
16、所述nc膜背离测试线的表面与所述基板设有工作电极的表面相贴合，所述测试线与所述工作电极正对设置；
17、样品垫，其一侧与所述nc膜贴合、另一侧与所述基板贴合；
18、吸收垫，其一侧与所述nc膜贴合、另一侧与所述基板贴合；
19、所述样品垫、吸收垫分别位于所述nc膜两侧；
20、pdms溶液池，其贴合在所述nc膜上，所述pdms溶液池上对应基板的工作电极、参比电极和对电极处开设有通孔以向所述pdms溶液池内加入pbs缓冲液。
21、优选的，所述的电化学发光检测afb1的试纸条基板上工作电极、参比电极和对电极的材料均为导电碳油墨。
22、第三方面，本专利技术还提供了一种电化学发光检测afb1的方法，包括以下步骤：
23、步骤1：将待测溶液与制备的电化学发光检测afb1探针混合得到待测样品，滴加在电化学发光检测afb1试纸条的样品垫上，通过测试线颜色变化定性检测待测样品中afb1；
24、步骤2：向电化学发光检测afb1试纸条的nc膜对应测试线区域滴加pbs缓冲液，将工作电极、参比电极和对电极与电化学工作站连接，通过电化学发光成像信号强度以实现对步骤1中滴加的待测样品中afb1的定量检测。
25、优选的，样品垫的制备方法为：将样品垫置于缓冲溶液中浸泡20～40min后，干燥，得到样品垫，其中，缓冲溶液包括tris-hcl、tritonx-100和nacl，其中，缓冲溶液中tris-hcl浓度为0.01～0.03m、tritonx-100质量浓度为0.1～0.4％、nacl浓度为0.1～0.3m。；
26、本专利技术的电化学发光检测afb1探针的制备方法、电化学发光成像试纸条的构建以及afb1检测方法相对于现有技术具有以下技术效果：
27、1、本专利技术的电化学发光检测afb1探针的制备方法，利用酰胺反应合成了ru-pei配合物，具体的，将[ru(dcbpy)3]2+水溶液与pei水溶液混合搅拌，最终得到ru-pei配合物；然后，用水解法合成ru-pei@sio2，再在其表面原位还原haucl4，得到ru-pei@sio2@au；向ru-pei@sio2@au中加入afb1抗体，搅拌，得到anti-afb-ru-pei@sio2@au共轭物，用bsa封闭多余位点，得到afb1响应双信号探针，用于afb1的检测；
28、2、本专利技术的电化学发光成像试纸条，构建了与电极一体化的试纸条，通过输出电化学发光成像与比色两种可视化信号，实现本专利技术试纸条两个信号间的本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种电化学发光检测AFB1探针的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.如权利要求1所述的电化学发光检测AFB1探针的制备方法，其特征在于，步骤1中Ru-PEI配合物的配制方包括：将[Ru(dcbpy)3]2+溶液与EDC/NHS混合溶液混合后搅拌20～40min，加入PEI溶液后于2～6℃下反应4～8h得到；
3.如权利要求1所述的电化学发光检测AFB1探针的制备方法，其特征在于，步骤2中将Ru-PEI配合物、水、氨水、乙醇混合后的搅拌时间为10～30min，加入TEOS后于20～25℃黑暗下搅拌10～15h；
4.如权利要求1所述的电化学发光检测AFB1探针的制备方法，其特征在于，步骤3中将含金化合物加入Ru-PEI@SiO2溶液后搅拌温度为50～70℃，加入柠檬酸钠溶液搅拌后以8000～12000r/min速率离心洗涤后分散至水中；其中，所述含金化合物包括HAuCl4、KAuCl4、NaAuCl4中的至少一种，所述含金化合物质量浓度为5～15％，柠檬酸钠溶液质量浓度为0.5～2％。
5.如权利要求1所述的电化学发光检测A
6.一种电化学发光检测AFB1的试纸条，其特征在于，包括：
7.如权利要求6所述的电化学发光检测AFB1的试纸条，其特征在于，所述样品垫的制备方法为：将样品垫置于缓冲溶液中浸泡20～40min后，干燥，得到样品垫；
8.如权利要求6所述的电化学发光检测AFB1的试纸条，其特征在于，所述基板上工作电极、参比电极和对电极的材料均为导电碳油墨。
9.一种一体化的AFB1检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
10.如权利要求9所述的一体化的AFB1检测方法，其特征在于，步骤1中电化学发光检测AFB1试纸条的比色信号可提供快速筛查依据，步骤2中电化学发光检测AFB1试纸条的电化学发光成像信号可提供AFB1的精确定量结果。
...【技术特征摘要】
1.一种电化学发光检测afb1探针的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.如权利要求1所述的电化学发光检测afb1探针的制备方法，其特征在于，步骤1中ru-pei配合物的配制方包括：将[ru(dcbpy)3]2+溶液与edc/nhs混合溶液混合后搅拌20～40min，加入pei溶液后于2～6℃下反应4～8h得到；
3.如权利要求1所述的电化学发光检测afb1探针的制备方法，其特征在于，步骤2中将ru-pei配合物、水、氨水、乙醇混合后的搅拌时间为10～30min，加入teos后于20～25℃黑暗下搅拌10～15h；
4.如权利要求1所述的电化学发光检测afb1探针的制备方法，其特征在于，步骤3中将含金化合物加入ru-pei@sio2溶液后搅拌温度为50～70℃，加入柠檬酸钠溶液搅拌后以8000～12000r/min速率离心洗涤后分散至水中；其中，所述含金化合物包括haucl4、kaucl4、naaucl4中的至少一种，所述含金化合物质量浓度为5～15％，柠檬酸钠溶液质量浓度为0....
【专利技术属性】
技术研发人员：陈苗苗，张修华，肖遥，熊成义，张民玲，
申请(专利权)人：湖北大学，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。