锌结合的谷胱甘肽S转移酶与金属硫蛋白融合蛋白制造技术

本发明专利技术涉及一种新型的锌结合融合蛋白，其为与锌结合的谷胱甘肽S转移酶(GST)与金属硫蛋白(MT)的融合蛋白，其提供预防或治疗ROS‑关联疾病以及重金属中毒的功效。

Zinc binding glutathione S transferase and metallothionein fusion protein

The invention relates to a novel zinc binding fusion protein, and the zinc binding glutathione S transferase (GST) and metallothionein (MT) fusion protein, which provides the prevention or treatment of ROS related diseases and the efficacy of heavy metal poisoning.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】锌结合的谷胱甘肽S转移酶与金属硫蛋白融合蛋白
本专利技术涉及一种新型锌结合融合蛋白，尤其是一种包含谷胱甘肽S转移酶与金属硫蛋白的锌结合融合蛋白。
技术介绍
金属硫蛋白(MT)是普遍存在的低分子量蛋白质，且是具有极高金属及半胱氨酸含量且可形成金属-硫醇丛集的多胜肽。MT基因族群含有4个亚群，称为MT1至MT4。越来越多的证据显示哺乳动物MT1/MT2异构物参与锌的恒定性，且对重金属毒性及氧化压力有防护作用。MT3主要表达于神经元，但也可表达于神经胶质细胞；MT4则大部分存在于分化中的多层鳞状上皮细胞。Vallee及Margoshe揭露由纯化来自马(马的)肾皮质的Cd-结合蛋白的MT(Margoshes&Vallee,“Acadmiumproteinfromequinekidneycortex”.JournaloftheAmericanChemicalSociety79(17):4813–4814,1957)。有四个主要的异构物在人类中表达(族群1，参见下图)：MT1(亚型：A、B、E、F、G、H、L、M、X)、MT2、MT3、MT4。可在不同的哺乳动物组织中发现不同的MT异构物。例如，MT1及MT2一般在所有器官中发现，MT4主要表达于分层的组织，但MT3则主要存在于大脑中。MT3还称为生长抑制因子(GIF)。MT在转录因子的调控上扮演重要的角色，因此细胞恶性转化以及最终的癌症可能因MT的功能或表达上的问题而造成(Krizkovaetal.,“Metallothionein--apromisingtoolforcancerdiagnostics”.BratislLekListy110(2):93–7,2009.)。据发现，在某些乳腺、结肠、肾脏、肝脏、皮肤(黑色素瘤)、肺脏、鼻咽、卵巢、前列腺、口腔、唾腺、睪丸、甲状腺以及膀胱的癌症中，MT的表达量增加；而在肝细胞癌及肝腺癌中，MT的表达量减少(Cherian,“Metallothioneinsinhumantumorsandpotentialrolesincarcinogenesis”.MutationResearch/FundamentalandMolecularMechanismsofMutagenesis533:201–209,2003.)。文献已提出重金属毒性是自闭症的一种假定病因，以及MT合成的功能障碍。然而，MT功能障碍并没有具体地与自闭症谱系障碍有所关联。根据2006年探讨孩童暴露于疫苗防腐剂硫柳汞的报导指出，相比于非自闭症孩童而言，在自闭症孩童中MT的含量及针对MT的抗体并无显著差异(Singh&Hanson,“Assessmentofmetallothioneinandantibodiestometallothioneininnormalandautisticchildrenhavingexposuretovaccine-derivedthimerosal”.PediatrAllergyImmunol17(4):291–6,2006.)。因此，有需要发展一种符合现有技术要求且关联于金属硫蛋白的新型融合蛋白，从而提供新的诊断或治疗试剂。
技术实现思路
本专利技术是基于非预期性地发现一种锌结合融合蛋白，其为一种与锌结合的谷胱甘肽S转移酶(GST)与金属硫蛋白(MT)的融合蛋白，其在治疗活性氧族群(ROS)关联疾病以及因急性或慢性暴露于重金属下所造成的重金属中毒上，提供非预期性的优异治疗效果。因此，本专利技术的一方面提供一种锌结合的GST与MT融合蛋白(GST-MT-Zn)。在本专利技术的一个实施例中，该GST-MT-Zn是GST-MT3-Zn。另一方面，本专利技术提供一种锌结合融合蛋白GST-MT3-Zn用于制造可预防或治疗ROS-关联疾病的药物的用途。又另一方面，本专利技术提供一种锌结合融合蛋白GST-MT3-Zn用于制造可预防或治疗一个体因急性或慢性暴露于重金属下所造成的重金属中毒的药物的用途。在另一方面，本专利技术提供一种药物组合物，其包含根据本专利技术的该锌结合融合蛋白GST-MT3-Zn与一种药学可接受载体。据信，本专利技术所属领域的技术人员可依据本专利技术而不须进一步阐明的情况下使用本专利技术至其最广的保护范围。因此，所提供的说明书和权利要求书应被理解为示范目的，而不是以任何方式限制本专利技术的范围。附图说明上述
技术实现思路
，以及以下本专利技术的详细描述，将由参阅附图而得到更佳的理解。为了说明本专利技术，在图中所揭示的为较佳的实施例。然而，应了解，本专利技术并不限定于所示的精确安排和手段。图1A显示构建的pGEX2T，包含人类MT3。图1B显示pGEX2T表达载体上MT3cDNA的序列。图2提供MT3氨基酸序列的比对，显示保守的关键半胱氨酸残基位置，其意味着，在不同物种间具有相同的功能相关性。图3显示GST-MT3的锌结合能力。图4显示，分别由PBS、GST、GST-MT3-Zn及GST-MT3处理的小鼠，其脑部经微型正子放射电脑断层造影(microPET)后以PMOD3.6(PMODTechnologies,Zurich,Switzerland)分析的结果。将小鼠分成4组(每组n＝3)，并在接受[18F]FDG前，分别以浓度为0.5μg/200μl的PBS、GST、GST-MT3-Zn及GST-MT3进行处理。使用微型PET针对小鼠的脑部进行扫描40分钟。图5显示SK-N-SH神经细胞分别经GST-MT3-Zn、GST-MT3及GST处理30分钟，以及以400μM的H2O2挑战4小时后的ROS含量。相对于经GST及GST-MT3处理而言，经GST-MT3-Zn处理的细胞似乎担任着抗-ROS清除剂的角色。进行三重复的测量，且由至少3个试验而获得统计分析结果。*p<0.05。图6显示对于Cd易感的SK-N-SH神经细胞在3uM下处理96小时，再分别以0.2μM、1μM及5μM的GST-MT3-Zn处理后的MTT检测结果。经指定浓度的GST-MT3-Zn处理的细胞对于经Cd诱导的神经细胞损伤有显著的救护效果。进行三重复的测量，且由至少3个试验而获得统计分析结果。*p<0.05。具体实施方式除非另有定义，本文使用的所有技术及科学术语具有与本领域技术人员对于本专利技术所属领域的理解相同的含义。本文件，包括定义，将可控制与本文冲突的情况。如本文所使用的，单数形式“一”，“一个”，及“该”包括多个对象，除非上下文另有明确说明。因此，例如，当提及“一个样本”包括多个这样的样品及本领域技术人员已知的等同物。如本文所使用的术语“谷胱甘肽S转移酶与金属硫蛋白的融合蛋白”、“GST与MT的融合蛋白”、或“GST-MT”是指一种谷胱甘肽S转移酶(GST)与金属硫蛋白(MT)的融合蛋白或一种其功能性变异体。该融合蛋白进一步包含一或多种化学修饰。该融合蛋白可通过GST融合于MT的N端，或者MT融合于GST的N端而达成。如本文所使用的术语“GST-MT-Zn”是指锌结合的GST与MT的融合蛋白。如本文所使用的术语“金属硫蛋白”是指编码着富含半胱氨酸且分子量低的蛋白质的基因族群，其可经由其半胱氨酸(Cys)残基上的硫醇基与重金属(例如Zn及Cu)结合。金属硫蛋白存在于各种本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种锌结合融合蛋白，其是一种与锌结合的谷胱甘肽S转移酶(GST)与金属硫蛋白(MT)的融合蛋白。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.03.13 US 62/132,7381.一种锌结合融合蛋白，其是一种与锌结合的谷胱甘肽S转移酶(GST)与金属硫蛋白(MT)的融合蛋白。2.根据权利要求1所述的锌结合融合蛋白，其进一步包含一或多种化学修饰作用。3.根据权利要求1所述的锌结合融合蛋白，其中该MT是MT3。4.根据权利要求1所述的锌结合融合蛋白，其中该GST融合于该MT的N端。5.根据权利要求1所述的锌结合融合蛋白，其中该MT融合于该GST的N端。6.根据权利要求3所述的锌结合融合蛋白，其中该MT3具有一种选自SEQIDNo:1-32所示的氨基酸序列的氨基酸序列。7.根据权利要求3所述的锌结合融合蛋白，其中该MT3是人类MT3。8.根据权利要求7所述的锌结合融合蛋白，其中该MT3具有SEQIDNo:1的氨基酸序列。9.一种包含权利要求1所述的锌结合融合蛋白以及一种药学上可接受载体的药物组合物。10.一种包含权利要求3所述的锌结合融合蛋白以及一种药...

【专利技术属性】
技术研发人员：林巧威，沈汤龙，陈克俭，林哲立，蔡升宏，
申请(专利权)人：大喆生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：中国台湾,71