本发明专利技术属于基因工程领域，涉及一种位点特异整合性慢病毒载体及其制备方法。该载体系统由ＦａｔｔｂＣ３１ＵＧＷ质粒、ＣＭＶΔ８．９－Ｄ６４Ｎ／Ｄ１１６Ｎ和包膜质粒ＶＳＶＧ组成。为了克服慢病毒载体系统随机整合导致插入突变之风险，本发明专利技术对现有慢病毒载体系统进行了改造，并通过与ｐｈｉＣ３１整合酶系统结合，获得了位点特异整合性慢病毒载体系统。该病毒载体携带的转基因可稳定整合在宿主基因组特定位点上。作为集有效性、安全性、操作简便性于一体的新型慢病毒载体，本发明专利技术一方面可用于鉴定外源基因的功能，尤其是在基因修饰的细胞工程中的作用；另一方面本发明专利技术为抑制肿瘤和抗病毒等领域的基因治疗提供了新的更安全更高效的途径。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于基因工程领域，涉及一种位点特异整合性慢病毒载体系统及其 制备方法。
技术介绍
慢病毒(Lentivirus)属于逆转录病毒亚属，以人类免疫缺陷病毒 (human i腿unodefficiency vims, HIV)为代表.慢病毒不仅具有感染分裂 靶细胞并整合其基因组中，尤其是具有感染包括神经元细胞、巨噬细胞、肝细胞、 心肌细胞和千细胞等在内的多种非分裂细胞能力，因而，慢病毒载体已作为基因 转移的有效工具，被广泛应用于基因功能尤其是基因治疗的研究。基于I型人类免疫缺陷型病毒(human i咖unodefficiency virus, type 1;HIV-1)的慢病毒载体目前已发展到第三代。第一代是复制缺陷型HIV-1的慢 病毒载体，仅获得较低的重组滴度，且仅能感染CD4的靶细胞，并存在产生野生 性HIV的严重危险。第二代慢病毒载体的一个重要改进，是采用了其它病毒的包 膜蛋白基因代替HIV的包膜蛋白基因，构建成假型慢病毒载体(pseudotype lentivirus vector)。该载体含有水泡性口炎病毒(vesicular stomatitis virus: VSV) e/7r蛋白G糖蛋白，使病毒颗粒非特异性地结合于靶细胞的膜磷脂，而不 需要特异性膜受体。第三代慢病毒载体，缺失了与病毒包装和感染无关的序列， 这些序列通常与病毒复制和致病性有关。第四代慢病毒载体，为自灭活性载体。 该类载体将3-LTR中所有参与病毒复制的非必需序列缺失，使其经包装产生的子 代重组病毒完全失去了复制能力，因而更安全。然而，同其它病毒如反转录病毒 一样，慢病毒的整合是随机的，因而常导致插入突变之风险，该风险巨大阻碍着 慢病毒载体系统在基因功能和基因治疗上的广泛地应用。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种位点特异整合性慢病毒载体系统，以克服慢病毒 载体系统随机整合导致插入突变之风险，赋予该类载体系统位点特异整合功能； 同时，通过改造包装载体，使该载体成为集有效性、安全性和操作简便性于一体 的新型慢病毒载体。本专利技术的另一个目的是提供上述载体的制备方法。本专利技术的再一个目的是提供一种位点特异整合试剂盒，用于将基因位点特 异性整合在基因组中。本专利技术提供了一种位点特异性整合慢病毒载体系统，由FattbC31UGW质粒、 CMVA8. 9-D64N/D116N和包膜质粒VSVG组成(其结构示意图分别如图1、 2和3 所示)；FattbC31UGW质粒是将attB位点序列和位点特异整合酶C31基因序列依 次连接并且克隆到FUGW载体的PACI酶切点而得；CMVA8. 9-D64N/D116N质粒是 由CMVA8. 9质粒中的pol基因D64N和D116N突变而得。FUGW、 pCMVA8. 9 (即CMVA8. 9质粒)及VSVG来源于美国Carlos Lois博 士惠赠。本专利技术的FUGW慢病毒载体来源于文章Lois C， et al. Germline transmission and tissue-specific expression of transgenes delivered by lentiviral vectors. Science, 2002,295:868-72。 FUGW以除去有害基因后的 HIV作为骨架，表达由泛素(Ubiquitin-C，UBC)调控的绿色荧光蛋白基因(EGFP); pCMVA8.9为包装结构质粒，主要起病毒包装功能，表达酶蛋白形成病毒衣壳结 构及整合酶(IN); VSVG为包膜质粒。一方面，包装载体CMVA8. 9-D64N/D116N是由CMVA8. 9中pol基因(其NCBI 登陆号AAC54634 )编码的HIV整合酶D64N和D116N双突变而成，使其仅有包 装功能而未整合作用。另一方面，FattbC31UGW质粒是由attB位点序列和位点 特异整合酶基因C31 (即phi C31,其NCBI登陆号AX816372)序列克隆到FUGW 载体的pad酶切点而得到，赋予了该载体位点特异整合的功能。新型慢病毒载体FattbC31UGW设计策略FUGW载体与attB位点序列和位点 特异整合酶基因phi C31的融合序列Attb-C31经PACI酶切，回收，连接而得到. 如下图所示。5LTRy3LTRyAttB-C31一ea^酶切回收，T4连接龍连^，5LTRatffi-C31UbiEGFP3LTRw新型慢病毒包装载体CMVA8. 9-D64N/D116N设计策略编码HIV整合酶基 因位于pol基因内，与整合有关残基被定向突变D64N/D116N,以此获得新型未整 合活性低的慢病毒包装载体CMVA8. 9-D64N/D116N如下图所示pCMVBata-globin intronGlg/po1RRE定向突变编码HIV整合酶残基 D64N/D1顧pCMVBata-globin intron —Glg/po卜D64/D116NRRE另一方面，本专利技术还提供了位点特异整合性慢病毒载体系统的制备方法， 该方法包括以下步骤(1) 获得Attb-C31编码序列；(2) 将(1)获得的序列克隆至FUGW载体pacl酶切位点获得质粒 FattbC31UGW;(3) 以质粒CMVA8. 9为模版，将pol基因中的D64N和D116N突变后得 到CMVA8. 9-D64N/D116N;(4) 将FattbC31UGW质粒、包膜质粒VSVG和包装结构质粒CMVA 8.9-D64N/D116N质粒混合，混合比例为1.5-10: 1-5: 1;即形成如权利要求1 所述慢病毒载体系统。本专利技术的制备方法中，(1)用PCR方法或者人工合成方法得到Attb-C31整 合酶编码序列。本专利技术的制备方法中，克隆序列可以采用PCR，人工合成，酶切等方法实现，拼接序列则可能采用酶切、退火、连接粘性末端等方法实现。本专利技术的制备方法(1)中，可以首先将attb序列插入CMV-c31质粒获得 重组CMV-Attb-C31质粒，然后用PCR方法或者人工合成方法得到AUb-C31整合 酶编码序列。例 如， 合 成 带 有 Kpnl/spel 酶 切 点 的 ATTB 寡 核 甘 酸 序 列经退火酶切回收后克隆到CMVC31质粒，得到重组CMV-ATTB-C31质粒.扩增 Attb-C31整合酶编码序列，所用引物含有pacl的酶切位点，PCR产物经酶切后回 收。CMV C31质粒来自美国Stanford University的Michele P. Calos教授，文 章出自"A phage integrase directs efficient site-specif ic integration in human cells, PNAS, 2000 ,97 ，5995 - 6000."本专利技术的制备方法(3)中，用定向突变方法获得了HIV整合酶突变的表达 载体CMVA8. 9-D64N/D116N。例如，以质粒CMV △ 8. 9为模版，合成寡核甘酸序列D64N， F-5-TATGGCAGCTAAATTGTACACATT-3 ; D64N， R-5-AATGTGTACAATTTAGCTGCCAT本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种位点特异整合性慢病毒载体系统，其特征在于，该载体系统由ＦａｔｔｂＣ３１ＵＧＷ质粒、ＣＭＶΔ８．９－Ｄ６４Ｎ／Ｄ１１６Ｎ和包膜质粒ＶＳＶＧ组成；ＦａｔｔｂＣ３１ＵＧＷ质粒是将ａｔｔＢ位点序列和位点特异整合酶Ｃ３１基因序列依次连接并且克隆到ＦＵＧＷ载体的ｐａｃＩ酶切点而得；ＣＭＶΔ８．９－Ｄ６４Ｎ／Ｄ１１６Ｎ质粒是由ＣＭＶΔ８．９质粒中的ｐｏｌ基因Ｄ６４Ｎ和Ｄ１１６Ｎ突变而得。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：朱焕章，刘绍辉，辛清婷，余龙，
申请(专利权)人：复旦大学，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]
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