一种诱导多能干细胞染色体的制备方法技术

本发明专利技术公开了一种诱导多能干细胞染色体的制备方法，包括如下步骤：（1）干细胞的培养；（2）细胞周期同步化；（3）干细胞收获：从培养瓶中提取干细胞获得细胞悬液；（4）滴片；（5）染色。本发明专利技术在干细胞核型鉴定时的染色体分辨率高，数量多，所以核型分析成功率高。

A method for the preparation of chromosomes in the induction of pluripotent stem cells

The invention discloses a preparation method of induced pluripotent stem cell chromosome, which comprises the following steps: (1) stem cells; (2) cell cycle synchronization; (3) stem cells harvested from the culture flask to extract stem cells: cell suspension was obtained; (4) drop; (5) dye color. This invention has high chromosome resolution and a large number of chromosomes in the identification of stem cell karyotype, so the success rate of karyotype analysis is high.

【技术实现步骤摘要】
一种诱导多能干细胞染色体的制备方法
本专利技术涉及一种染色体的制备方法，特别涉及一种诱导多能干细胞染色体的制备方法。
技术介绍
诱导多能干细胞(InducedPluripotentStemCells,iPSCs)是指体细胞经过重编程，转化为具有胚胎干细胞特性和功能的多能干细胞。对诱导多能干细胞的研究始于2006年，日本Takahashi等首次以成人成纤维细胞为基础诱导出诱导多能干细胞，并证实获得的细胞具有胚胎干细胞的特性和功能，掀起诱导干细胞研究的热潮。目前证实，诱导多能干细胞与胚胎干细胞类似，可以自我更新并可分化成各种类型的体细胞，不仅在替代疗法上有重要价值，还可用于体外疾病模型的建立，用于疾病机制的研究、药物的监测以及新治疗方法的检验。研究表明，在现有的体外培养条件下，诱导多能干细胞在多次传代后会发生染色体核型的变异，即染色体的数目发生改变或结构发生异常。已知的影响因素包括培养温度的变化、血清的使用、滋养层细胞的种类和状态、分化抑止因子的加入、传代操作是否涉及到消化酶以及冻存复苏操作等。最常见的染色体异常包括12号、17号和X染色体的三体和结构变异，并且此类细胞在继续培养过程中，本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种诱导多能干细胞染色体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：（1）干细胞的培养：干细胞置于37℃、5%浓度CO2的培养箱中开放式培养，培养基每日换液；（2）细胞周期同步化：在干细胞收获前一天上午8:00更换新鲜培养基， 上午10:00向培养瓶中加入100微升氟脲嘧啶脱氧核苷，继续放入培养箱培养；次日8:00向培养瓶中加入200µl胸腺嘧啶，继续培养，上午11:00向培养瓶中加入100µl 秋水仙素，混匀后培养箱放置15分钟，取出培养瓶，用于收获干细胞；（3）干细胞收获：从培养瓶中提取干细胞获得细胞悬液；（4）滴片：将细胞悬液滴于载玻片上并固定得固定片；（5）染色：将固定片染色后得染色体玻片。

【技术特征摘要】
1.一种诱导多能干细胞染色体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：（1）干细胞的培养：干细胞置于37℃、5%浓度CO2的培养箱中开放式培养，培养基每日换液；（2）细胞周期同步化：在干细胞收获前一天上午8:00更换新鲜培养基，上午10:00向培养瓶中加入100微升氟脲嘧啶脱氧核苷，继续放入培养箱培养；次日8:00向培养瓶中加入200µl胸腺嘧啶，继续培养，上午11:00向培养瓶中加入100µl秋水仙素，混匀后培养箱放置15分钟，取出培养瓶，用于收获干细胞；（3）干细胞收获：从培养瓶中提取干细胞获得细胞悬液；（4）滴片：将细胞悬液滴于载玻片上并固定得固定片；（5）染色：将固定片染色后得染色体玻片。2.根据权利要求1所述的一种诱导多能干细胞染色体的制备方法，其特征在于，步骤（2）中，氟脲嘧啶脱氧核苷的浓度为1µg/ml。3.根据权利要求1所述的一种诱导多能干细胞染色体的制备方法，其特征在于，步骤（2）中，胸腺嘧啶的浓度为2.4mg/ml。4.根据权利要求1所述的一种诱导多能干细胞染色体的制备方法，其特征在于，步骤（2）中，秋水仙素的浓度为20µg/ml。5.根据权利要求1所述的一种诱导多能干细胞染色体的制备方法，其特征在于，步骤（3）干细胞收获具体为：A、将培养瓶中的培养基吸入离心管中，加入生理盐水2ml冲洗培养瓶，冲洗液也吸入离心管中；B、向培养瓶中加入0.25%EDTA-胰酶消化液1ml，消化5min；将消化下来的细胞吸入离心管中，以生理盐水冲洗培养瓶3-5次，将培养瓶冲洗干净；C、离心管在1500rpm转速下离心8min；去上清液，向离心管中加入室温或37℃预热的0.075mol/L的KCl低渗液0.5ml，置于涡旋振荡器上10-15s，充分混匀；继续加入0.075mol/L的KCl低渗液至10ml刻度，盖紧盖子，颠倒混匀，置37℃水浴箱低渗10分钟；D、低渗时间到后缓慢沿管壁加入0.5ml固定液，盖紧盖子，颠倒混匀，1500rpm转速下离心8min，用真空吸痰器吸去部分上清液，留高度3-5mm液面，置于涡旋振荡器上10-15s，充分混匀，加入固定液至8ml刻度处，盖紧盖子，颠倒混匀，1500rpm转速下离心8min；E、用真空吸痰器吸去固定液，留高度...

【专利技术属性】
技术研发人员：王昊，吴凌峰，梁平，
申请(专利权)人：杭州市妇产科医院，
类型：发明
国别省市：浙江,33