用于检测单克隆抗体的样品调制用试剂盒制造技术

提供样品调制用试剂盒，该样品调制用试剂盒用于提供不受抗体的多样性、种间差、基质等影响的、通用性极高的分析手法。提供一种用于通过高效液相质谱分析(LC‑MS)检测单克隆抗体的样品调制用试剂盒，其包括：多孔体，其用于使作为测定对象的单克隆抗体固定化；纳米颗粒，其固定化有蛋白酶；反应容器，其用于使前述多孔体与前述纳米颗粒接触而选择性地消化单克隆抗体；缓冲液，其与前述纳米颗粒和多孔体一起被导入至前述反应容器内、且用于利用前述蛋白酶进行消化反应；以及、过滤膜，其用于在前述消化反应后将前述多孔体和前述纳米颗粒去除、且将前述消化反应的产物与前述缓冲液一起提取。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于检测单克隆抗体的样品调制用试剂盒技术区域本专利技术涉及用于通过质谱分析检测单克隆抗体的样品调制用试剂盒，更具体而言，涉及用于选择性地消化包含单克隆抗体的特异性的序列的肽片段且能够进行更有效的分析的试剂盒。
技术介绍
新药研发领域中的最大课题是副作用少且发挥高的药效的药物的开发。为此目前关注的是药物动力学、特别是浓度监测(therapeuticdrugmonitoring(治疗药物监测),TDM)。以处方药是否为适当量、是否到达病变部位为指标进行了种子的筛选，由此早期发现漏掉的药，可以将该信息有效地用于早期新药研发开发、临床试验。以前，对也被称为订制医疗的个别化医疗有所期待，但现实中使医疗技术、药品个别化时，除了一部分富裕层以外，从医疗经济的观点出发是不现实的。因此，逐渐进行了将能够获得的医疗设备、药品送至实际上有治疗效果的患者的尝试，将其称为最佳化医疗。药品开发中的对最佳化医疗的最大尝试是使用了TDM的新药研发开发。特别是癌、自身免疫疾病等领域中，最近被称为分子靶向药的新药研发是主流。重要的是，分子靶向药的有效的药效可以通过医生自身测定是否蓄积于病变部位而发挥药效来进行判断。作为分子靶向药，现在，以病原蛋白质为靶抗原的抗体药物受到关注。抗体是原本存在于体内的蛋白质，因此，预想副作用低，为了提高分子靶效果，也可以以高浓度给予。进而，抗体药物也适于使用多种药品的鸡尾酒疗法，也有可以显著地得到成功的症例报道。另外，作为来自靶向给药领域的解决方法，抗体上结合有低分子抗癌剂的下一代抗体药物(抗体药物缀合物)也登场。进而，也出现了通过糖链改变使药效增强的抗体；使免疫细胞活化而发挥抗癌效果的、所谓免疫检测位点抗体等，预想抗体药物的需求今后逐渐提高。抗体在其性质上显示出极高的分子特异性，据说在成为靶标的病变蓄积，但准确验证其的技术还不存在。另外，也存在如下争议抗体药物本身的药价的问题，所谓基于适当使用的最佳化医疗对于患者在医疗经济上也是重要的。为此，通过测定抗体药物的局部存在、浓度，设定最佳的给药量也是重要的。进而，用于准确观察给予的药物的药效指标进行药理评价的、抗体药物浓度的定量也有较大的需求。用于抗体等蛋白质的定量的最一般的技术为ELISA(酶联免疫吸附试验(Enzyme-LinkedImmunoSorbentAssay))。其是如下技术：制作针对测定对象的蛋白质的抗体，进而用检测用抗体进行夹心，由此简便地定量测定对象分子。ELISA是通用性极高的技术，而且也具备自动化支援环境，因此，预想今后作为诊断技术成为黄金标准。然而，ELISA中存在如下较多课题：例如由于没有对测定对象进行直接测定，因此有时出现异常值；而且需要对每个测定对象制作抗体；耗费时间、成本；无法同时测定多个解析对象等。特别是关于抗体药物，也产生与内源性抗体的交叉反应，准确的测定较难。进而，以中和抗体与抗原结合的状态占据抗原识别部位，无法以ELISA测定的情况也较多。另外，在动物试验阶段中采用的ELISA的分析条件下，由于种间交叉的问题也经常无法直接用于大型动物、人。即，在新药研发开发阶段和人临床试验中，不得不在各种测定条件下进行比较。病变组织中的药剂浓度的ELISA中，妨碍检测的基质成分不同，因此，为了以ELISA基础进行药物动力学，必须制作多个抗体。这导致巨大的成本、后期开发的落后等非常大的风险。另一方面，使用了质谱分析的蛋白质的定量和结构解析与质谱分析技术、数据解析服务器·软件的发展一起，飞跃性地扩展其应用范围。特别是，使用质谱分析的绝对定量技术作为不依赖于特异性的抗体的方法而辨识度提高。例如，对没有市售抗体的蛋白质进行定量时，以往，需要将蛋白质大量地纯化，但通过使用质谱分析省略了该步骤，因此效率飞跃性地提高。医学的领域中，以往由于病理切片的薄切方法、保存方法等医生手法的误差、设施间差等问题而免疫组织染色中出现差异，可能经常引起难以判定阳性、假阳性、阴性的情况。针对于此，通过对病理切片中的目标病原蛋白质以质谱分析进行定量，由此，可以判定是否为高表达蛋白质。进而最近，处于被称为激光显微切割的、切出一个细胞的装置能够通用的情况。例如，可以仅将癌细胞回收，对该细胞内的病原蛋白质的表达变动解析以质谱分析进行直接观察。这特别是病理、临床现场中极其划时代的技术革新，是期望分析技术的标准化等的准备的情况。尽管是利用精度高的分析技术，但利用质谱分析检测生物学样品中的蛋白质时，大多将测定对象的蛋白质进行蛋白酶解而片段化，因此，从包含杂质的各种肽片段有效地选择目标肽片段变得重要。专利文献1中，为了检测样品中的抗体，公开了：使用胃蛋白酶，与非免疫球蛋白蛋白质的分解一起将抗体消化，使F(ab’)2片段产生后，进一步进行胰蛋白酶消化。另外，专利文献2是在先于质谱分析的液相色谱法阶段，仅以适当分离的肽为定量对象进行选择的。非专利文献1是使用抗肽抗体将测定对象肽进行浓缩的。另外，近年来，作为蛋白酶解的高效率化手法，在纳米颗粒等微小环境(微反应器)内进行蛋白酶解的方法受到关注。例如，非专利文献2中报道了，通过使用细孔内固定有胰蛋白酶的介孔二氧化硅，由此可以将分子量小的蛋白质选择性地进行胰蛋白酶消化。非专利文献3中报道了如下例子：在尼龙膜上固定化胰蛋白酶，使蛋白质的胰蛋白酶消化高效率化。这些方法均是使蛋白酶固定化于多孔体的细孔内，使固相表面的蛋白酶与液相内的底物蛋白质反应的方法。非专利文献4提出了用于识别样品中的单克隆抗体与内源性的抗体的高通量法。自经过石蜡包埋的病理切片的蛋白质回收由AgilentTechnologies、AMR、Qiagen等以试剂盒的形式被销售。另外，针对经过利用自病理切片的癌细胞激光显微切割的回收、脱石蜡处理、蛋白质提取和消化，利用质谱分析进行病变蛋白质的定量和临床相关进行了发表。现有技术文献专利文献专利文献1：日本特表2010-515020号专利文献2：日本特开2012-197258号非专利文献非专利文献1：N.LeighAnderson等,MassSpectrometricQuantitationofPeptidesandProteinsUsingStableIsotopeStandardsandCapturebyAnti-PeptideAntibodies(SISCAPA),JournalofProteomeResearch,2004,3(2),235非专利文献2：QianhaoMin等,Size-selectiveproteolysisonmesoporoussilica-basedtrypsinnanoreactorforlow-MWproteomeanalysis,ChemicalCommunications,2010,46,6144非专利文献3：FeiXu等,FacileTrypsinImmobilizationinPolymericMembranesforRapid,EfficientProteinDigestion,AnalyticalChemistry,AnalyticalChemistry,2010,82,10045非专利文献4：XiaotaoDuan等,High-ThroughputMethodDevelopmentf本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于通过高效液相质谱分析(LC‑MS)检测单克隆抗体的样品调制用试剂盒，其包括：多孔体，其用于使作为测定对象的单克隆抗体固定化；纳米颗粒，其固定化有蛋白酶；反应容器，其用于使所述多孔体与所述纳米颗粒接触而选择性地消化单克隆抗体；缓冲液，其与所述纳米颗粒和多孔体一起被导入至所述反应容器内、且用于利用所述蛋白酶进行消化反应；以及过滤膜，其用于在所述消化反应后将所述多孔体和所述纳米颗粒去除、且将所述消化反应的产物与所述缓冲液一起提取。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.03.10 JP 2015-0477291.一种用于通过高效液相质谱分析(LC-MS)检测单克隆抗体的样品调制用试剂盒，其包括：多孔体，其用于使作为测定对象的单克隆抗体固定化；纳米颗粒，其固定化有蛋白酶；反应容器，其用于使所述多孔体与所述纳米颗粒接触而选择性地消化单克隆抗体；缓冲液，其与所述纳米颗粒和多孔体一起被导入至所述反应容器内、且用于利用所述蛋白酶进行消化反应；以及过滤膜，其用于在所述消化反应后将所述多孔体和所述纳米颗粒去除、且将所述消化反应的产物与所述缓冲液一起提取。2.根据权利要求1所述的试剂盒，其中，所述过滤膜在不施加压力或离心力的条件下基本不能使所述缓冲液和由利用所述蛋白酶的消化反应生成的肽透过；而在施加压力或离心力的条件下能使所述缓冲液和所述肽透过。3.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其中，所述过滤膜为聚偏二氟乙烯(PVDF)制的膜。4.根据权利要求1～3中任一项所述的试剂盒，其中，所述试剂盒为用于同时处理多个试样的试剂盒，所述过滤膜的壳体原材料为聚丙烯腈树脂。5.一种用于利用高效液相质谱分析(LC-MS)进行单克隆抗体检测的试剂盒，其在权利要求1～4中任一项所述的试剂盒中还包括记载有用于检测单克隆抗体的质谱分析条件的说明书。6.根据权利要求1～5中...

【专利技术属性】
技术研发人员：嶋田崇史，岩本典子，
申请(专利权)人：株式会社岛津制作所，
类型：发明
国别省市：日本,JP