一种维持间充质干细胞活性的运输保存液与制备方法技术

本发明专利技术公开了一种能有效维持间充质干细胞活性的运输保存液及其制备方法，该保存液由溶液介质和细胞活力保护剂组成；其中溶液介质为复方电解质注射液，添加终浓度为0.05g/ml人血白蛋白；细胞活力保护剂包括复方氨基酸、褪黑激素和雷帕霉素，终浓度分别为0.4～1.6mg/ml、0.23～2.3μg/ml、20～200nM；复方氨基酸能够给间充质干细胞提供能量，褪黑激素和雷帕霉素能够激活细胞自噬效应，促进间充质干细胞的生存能力，本发明专利技术提供的运输保存液能在24小时内有效维持间充质干细胞的活力，保障远距离运输中干细胞的稳定性。

Transport preservation solution for maintaining the activity of mesenchymal stem cells and its preparation method

The invention discloses a can effectively maintain the mesenchymal stem cell activity in the transportation and storage of liquid and a preparation method thereof. The preservation solution is composed of aqueous medium and cell viability of protective agents; the solution for Multiple Electrolytes Injection, adding a final concentration of 0.05g/ml Human Albumin; cell viability protective agent including amino acids, melatonin and rapamycin, final concentration were 0.4 ~ 1.6mg/ml and 0.23 ~ 2.3 g/ml, 20 ~ 200nM; compound amino acid to mesenchymal stem cells to provide energy, melatonin and rapamycin can activate autophagy effect, promote mesenchymal stem cell survival ability, effectively maintain within 24 hours of mesenchymal stem cells activity can save transportation the liquid provided by the invention, the protection of the stability of stem cells in long distance transportation.

【技术实现步骤摘要】
一种维持间充质干细胞活性的运输保存液与制备方法
本专利技术涉及干细胞保存液
，具体涉及一种维持间充质干细胞活性的保存液及其制备方法。
技术介绍
间充质干细胞(MesenchymalStemCells，MSCs)来源于发育早期的中胚层，是一类具有自我复制和多向分化潜能的原始细胞，广泛存在于机体各个组织和器官中，如新生儿脐带、骨髓、脂肪等；在特定的条件下它能分化成多种组织特异性细胞，如成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、神经细胞、心肌细胞等。MSCs具有免疫调节和组织修复能力，通过旁分泌效应作用于靶细胞，达到治疗移植物抗宿主疾病、炎症性疾病、骨骼疾病、心脏疾病、神经系统疾病的目的。目前MSCs的临床研究多采用的是异体通用型细胞制品，一方面可以节约制备时间和成本，另外一方面也有利于临床疗效的评估。为了推动干细胞的临床研究和应用，国家和地方成立了区域细胞制备中心和间充质干细胞库，规范了细胞制品的制备和质量管理。使用干细胞制品涉及到一个技术性问题，就是MSCs在体外的保存和运输时间受到细胞活力的限制。现有的MSCs运输保存液中添加葡萄糖、维生素C、肝素等作为保护剂，以提高MSCs在较长时间运输过程中的细胞活率。但是这些保护剂的作用有限，活力维持时间一般在12小时左右，长时间保存后(24小时)细胞活率会降至90％以下，这一定程度上限制了MSCs的应用范围，同时也会影响MSCs的治疗效果。
技术实现思路
基于以上背景，本专利技术提供了一种维持间充质干细胞活性的运输保存液及其制备方法。本专利技术提供的间充质干细胞保存液能在24小时内维持细胞活率在90％以上，从而可以实现间充质干细胞的远距离运输，扩大其临床使用地域范围。为了实现上述目的，本专利技术所采用的技术方案为：本专利技术提供了一种维持间充质干细胞活性的运输保存液，包括溶液介质和细胞活力保护剂。进一步地，本专利技术制备的间充质干细胞运输保存液，使用的溶液介质为复方电解质注射液。本专利技术制备的间充质干细胞运输保存液，使用的细胞活力保护剂为复方氨基酸、褪黑激素(melatonin)以及雷帕霉素(rapamycin)，均为临床使用级别；复方氨基酸可为细胞提供营养，褪黑激素和雷帕霉素能够诱导细胞自噬。进一步地，本专利技术的间充质干细胞运输保存液具体配方为：复方氨基酸：0.4～1.6mg/ml；褪黑激素：0.23～2.3μg/ml；雷帕霉素：20～200nM；人血白蛋白：0.05g/ml；复方电解质注射液：补足。作为优选，复方氨基酸(18AA)为原液浓度为0.09g/ml的复方氨基酸注射液；褪黑激素为原液浓度为0.115mg/mL的褪黑激素溶液；雷帕霉素为原液浓度为10μM的雷帕霉素溶液。在本专利技术的实施例中,复方氨基酸(18AA)其组份为250ml含脯氨酸1.40g、丝氨酸0.90g、丙氨酸3.50g、异亮氨酸1.25g、亮氨酸1.65g、门冬氨酸0.78g、酪氨酸0.07g、谷氨酸1.25g、苯丙氨酸1.65g、精氨酸盐酸盐1.40g、赖氨酸盐酸盐1.92g、缬氨酸1.48g、苏氨酸0.95g、组氨酸盐酸盐1.10g、色氨酸0.35g、甲硫氨酸1.25g、胱氨酸0.05g、甘氨酸1.65g。在本专利技术的实施例中，细胞活力保护剂复方氨基酸、褪黑激素和雷帕霉素的浓度分别为0.9mg/mL、1.15μg/mL和100nM。在本专利技术的实施例中，间充质干细胞优选为第4代脐带来源间充质干细胞。本专利技术还提供了该间充质干细胞运输保存液的制备方法：将复方电解质注射液、人血白蛋白、复方氨基酸、褪黑激素和雷帕霉素按上述规定浓度混匀，过滤除菌，得到混合液；然后使用上述混合液重悬脐带来源间充质干细胞，细胞密度为1×106cells/mL。本专利技术人创造性的发现，跟现有技术相比，有以下突出的优点：(1)本专利技术的运输保存液中的细胞活力保护剂中的复方氨基酸，能够给间充质干细胞提供一定的能量，相较于传统的细胞运输保存液中葡萄糖而言具有更好的保护作用；(2)本专利技术的间充质干细胞运输保存液所使用的细胞活力保护剂中的褪黑激素和雷帕霉素，能够在不适宜细胞生存的条件下激活细胞自噬效应，有助于细胞清除过量的，有害的蛋白或细胞器，从而促进间充质干细胞在不适条件下的生存能力；(3)本专利技术的间充质干细胞运输保存液能有效维持干细胞的活力，在4℃保存条件下维持干细胞活率>90％长达24小时，扩大了间充质干细胞的临床使用地域范围。附图说明下面结合附图和具体实施方式对本专利技术作进一步详细的说明。图1为褪黑激素和雷帕霉素诱导间充质干细胞发生自噬的westernblotting检测结果；其中，组1：复方电解质；组4：复方电解质+人血白蛋白+复方氨基酸+褪黑素；组5：复方电解质+人血白蛋白+复方氨基酸+雷帕霉素；组6：复方电解质+人血白蛋白+复方氨基酸+雷帕霉素+褪黑素。具体实施方式下面给出一种根据本专利技术制备的运输保存液的非限定性的实施例。实施例1复方氨基酸对于间充质干细胞的保护作用为了比较复方氨基酸和葡萄糖对于间充质干细胞活力的保护作用，本实施例中将间充质干细胞运输保存液分为3组不同配方。组1：不含细胞活力保护剂：将复方电解质注射液75ml、原液浓度为20％人血白蛋白25ml(终浓度为0.05g/ml)混匀。组2：只包含葡萄糖：将复方电解质注射液72ml、原液浓度为20％人血白蛋白25ml(终浓度为0.05g/ml)、原液浓度为0.05g/ml的葡萄糖注射液3ml(终浓度为1.5mg/ml)混匀。组3：只包含复方氨基酸：将复方电解质注射液74ml、原液浓度为20％人血白蛋白25ml(终浓度为0.05g/ml)、原液浓度为0.09g/ml的复方氨基酸注射液(18AA)1ml(终浓度为0.9mg/ml)混匀。将上述各组配方的运输液使用孔径0.2μm过滤器过滤除菌，得到混合液；然后将P4代间充质干细胞(1×106个)重悬于上述混合液中(1ml)，从而制得间充质干细胞注射液。将上述各组间充质干细胞注射液置于4℃冰箱，然后分别在指定时间点(0、4、8、12、24小时)取样进行细胞活率测定。细胞活率测定采用0.4％台盼蓝染色法，使用Countstar全自动细胞计数仪进行计数，结果如表1所示。表1间充质干细胞在各组运输保存液配方中的活率检测结果从表1可以看出，本实施例中不添加细胞活力保护剂的情况下，间充质干细胞的保存时间不能超过8小时(活率为～85％)，添加复方氨基酸能一定程度增加细胞活率，而葡萄糖对于间充质干细胞没有保护作用。实施例2褪黑激素和雷帕霉素对于间充质干细胞的保护作用为了进一步优化运输保存液的配方，本实施例在添加复方氨基酸的基础上再加上细胞活力保护剂褪黑激素、雷帕霉素，并测定褪黑激素、雷帕霉素对于间充质干细胞活力的保护作用。本实施例中将间充质干细胞运输保存液分为3组。组4：包含复方氨基酸和褪黑激素：将复方电解质注射液73ml、原液浓度为20％人血白蛋白25ml(终浓度为0.05g/ml)、原液浓度为0.09g/ml的复方氨基酸注射液(18AA)1ml(终浓度为0.9mg/ml)、原液浓度为0.115mg/ml褪黑激素溶液1ml(终浓度为1.15μg/ml)混匀。组5：包含复方氨基酸和雷帕霉素：将复方电解质注射液73ml、原液浓度为20％人血白蛋白25ml(本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种维持间充质干细胞活性的运输保存液，包括溶液介质和细胞活力保护剂，溶液介质为复方电解质注射液，添加终浓度为0.05g/ml人血白蛋白；细胞活力保护剂包括复方氨基酸、褪黑激素和雷帕霉素，终浓度分别为0.4～1.6mg/ml、0.23～2.3μg/ml、20～200nM。

【技术特征摘要】
1.一种维持间充质干细胞活性的运输保存液，包括溶液介质和细胞活力保护剂，溶液介质为复方电解质注射液，添加终浓度为0.05g/ml人血白蛋白；细胞活力保护剂包括复方氨基酸、褪黑激素和雷帕霉素，终浓度分别为0.4～1.6mg/ml、0.23～2.3μg/ml、20～200nM。2.根据权利要求1所述的运输保存液，其特征在于，所述的复方氨基酸为原液浓度为0.09g/ml的复方氨基酸(18AA)注射液，褪黑激素为原液浓度为0.115mg/ml的褪黑激素溶液；雷帕霉素为原液浓度为10μM的雷帕霉素溶液。3.根据权利要求1所述的运输保存液，优选的，细胞活力...

【专利技术属性】
技术研发人员：左凤琼，陈勇军，幸倚帆，程威，谭小虎，
申请(专利权)人：成都康景生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：四川,51