一种分离纯化替考拉宁的方法技术

本发明专利技术提供了一种分离纯化替考拉宁的方法，具体步骤包括：陶瓷膜过滤替考拉宁发酵液；大孔吸附树脂柱层析；阳离子交换树脂柱吸附、洗脱；洗脱液纳滤浓缩；反向层析树脂柱吸附、洗脱；活性炭脱色；脱色液纳滤浓缩；超滤过滤，纳滤浓缩；冻干。该方法克服了替考拉宁现有提取技术的不足，提高了替考拉宁的纯度。

A method for separation and purification of teicoplanin

The present invention provides a method for separation and purification of teicoplanin, specific steps include: ceramic membrane filtration of teicoplanin fermentation liquid; macroporous resin column chromatography; cation exchange resin column adsorption and desorption eluent; nanofiltration; reverse adsorption resin column chromatography, elution; activated carbon; decolorization liquid nanofiltration; ultrafiltration, nanofiltration freeze concentration. This method overcomes the shortcomings of the existing teicoplanin extraction technology, improves the purity of teicoplanin.

【技术实现步骤摘要】
一种分离纯化替考拉宁的方法
本专利技术属于生物医药
，具体涉及一种分离纯化替考拉宁的方法。
技术介绍
替考拉宁(Teicoplanin)为替考游动放线菌发酵产生的一组糖肽类抗生素，是继国际公认的抗耐药菌抗生素万古霉素后开发的另一种抗耐药菌糖肽类抗生素，主要对革兰氏阳性需氧和厌氧菌具有较强的抗菌活性，特别对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)引起的感染有很好的疗效，是目前临床上为数不多的仍具有对多重耐药性金黄色葡萄球菌和肠球菌有抗菌活性的药物之一。替考拉宁是游动放线菌发酵生产的由多种成分组成的混合物，结构复杂，对热、酸、碱稳定性差，生产过程中容易引起失活和分解，且发酵液中替考拉宁的含量较低，一般都需要较复杂的分离纯化过程。专利CN101302248A中提出了向替考拉宁浓缩液中添加丙酮进行结晶或盐析结晶的方法。但是该项专利中提及的工艺繁琐，生产设备投入大，超滤浓缩会增加浓液杂质浓度，并且所使用的有机溶剂易污染环境，盐析结晶过程中还会容易含有金属盐离子，引入杂质，降低样品纯度与效价。替考拉宁是5个化学结构十分相似化合物TeicoplaninA2(TA2-1、TA2-2、TA2-3、TA2-4、TA2-5)和去酰基葡糖胺TeicoplaninA3(T-A3)组成的混合物，结构复杂，对热、酸、碱稳定性差，生产过程中容易引起失活和分解，且发酵液中替考拉宁的含量较低，目前采用的分离纯化过程较复杂。替考拉宁主要的提取方法有：溶媒萃取法、吸附法、色谱法。溶媒萃取法由于溶剂使用量大，分离纯化效果差，制备的最终产品纯度低，所以目前该法已经很少采用。色谱法，由于使用的色谱填料昂贵，生产成本高，不利于工业化运用。吸附法采用的主要介质为大孔吸附树脂、活性炭等，其原料易得、价格低廉，替考拉宁纯化效果好，已成为替考拉宁提取的主要方法。替考拉宁单组份的结构式
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种分离纯化替考拉宁的方法。该方法克服了替考拉宁现有的提取技术的不足，提供一种工艺简便，经济，安全，低污染的替考拉宁提取方法。本专利技术主要包括如下步骤：1)陶瓷膜过滤替考拉宁发酵液；2)大孔吸附树脂柱层析；3)阳离子交换树脂柱吸附、洗脱；4)洗脱液纳滤浓缩；5)反向层析树脂柱吸附、洗脱；6)活性炭脱色；7)脱色液纳滤浓缩；8)超滤过滤，纳滤浓缩；9)冻干。具体的包括如下操作步骤：1)陶瓷膜过滤替考拉宁发酵液将替考拉宁发酵液用1mol/L氢氧化钠溶液调pH至10.5～11.5，控制料液温度范围20～40℃进行陶瓷膜过滤，当过滤至陶瓷膜未透过液体积为发酵液初始体积的30％～35％时，对陶瓷膜未透过液进行清洗，向陶瓷膜未透过液中加入发酵液初始体积的0.15～0.2倍纯化水或酒精度5％～20％乙醇溶液，后循环5分钟开始收集陶瓷膜透过液，当发酵液再次浓缩到初始体积的30％～35％时继续向发酵液中加入纯化水或酒精度5％～20％乙醇溶液，如此循环，直到剩余液中替考拉宁占发酵液中替考拉宁总量的0.1倍以下，陶瓷膜过滤结束，收集陶瓷膜透过液。2)大孔吸附树脂柱层析将收集的陶瓷膜透过液中加入无水乙醇，调节酒精度为15％～20％，用1mol/L盐酸调节pH值6～7。上样大孔吸附树脂柱，树脂型号为HZ818或XAD16，树脂柱径高比1:3～4，流速1～2倍柱体积/小时，上样结束后用酒精度10％～20％乙醇溶液冲洗树脂柱4-5倍柱体积，后用酒精度80％～90％乙醇溶液洗脱，流出液颜色变深时，开始收集洗脱液，当洗脱液单位低于600mg/L时洗脱结束，根据HPLC检测结果收集洗脱液。用酒精度85％～90％乙醇洗脱吸附在柱子上的杂质至无杂质峰出现，最后用酒精度10％～20％乙醇对树脂柱进行平衡处理。3)阳离子交换树脂柱吸附、洗脱树脂型号D113，树脂柱径高比1:1～2。取上步收集液上样阳离子交换树脂柱，流速5～7倍柱体积/小时，上样结束后用纯化水冲洗树脂柱，然后用0.2～0.5mol/L乙酸溶液洗脱，洗脱液单位约1000mg/L时开始收集，0.2～0.5mol/L乙酸继续洗脱，收集洗脱液，直到洗脱液单位低于200mg/L时，结束收集。4)洗脱液纳滤浓缩将收集的洗脱液进行纳滤以除去小分子量的杂质，并对收集液进行浓缩。控制温度在20～40℃，浓缩至单位20～30g/L，然后用纯化水流加入纳滤浓缩液，继续浓缩，以除去其中的乙酸。5)反向层析树脂柱吸附、洗脱选用SKP树脂柱层析，树脂柱径高比1:1～2。将上步浓缩液用纯化水稀释4～6倍后，用乙酸调节pH值至2.3～3.5作为待上样液，上样，上样流速2～3倍柱体积/小时，上样结束后，用10～20％丙酮水溶液(以V/V计，丙酮：水＝1:4～9；即10％丙酮的意思是以V/V计，丙酮：水＝1:9)(含乙酸铵2～3g/L，pH值3～4)冲洗树脂柱3～5倍柱体积，然后用20～25％丙酮水溶液(以V/V计，丙酮：水＝1:3～4)(含乙酸铵2～3g/L，pH值3～4)进行洗脱，每约0.1倍柱体积收集于一个容器，流出液单位低于100mg/L时，结束收集，用HPLC检测收集液，根据检测结果进行合并。6)活性炭脱色向替考拉宁洗脱液中加入活性炭，其中替考拉宁与活性炭重量比为1:0.5～1，搅拌0.5～1小时，过滤除炭，收集滤液，后用20～25％丙酮水溶液(以V/V计，丙酮：水＝1:3～4)(含乙酸铵2～3g/L，pH值3～4)冲洗活性炭滤饼，收集滤液，直至冲洗液替考拉宁单位低于100mg/L时，结束收集。7)脱色液纳滤浓缩取上步收集的脱色液过纳滤膜进行浓缩，控制温度在20～40℃，浓缩至单位20～30g/L时，用纯化水流加入纳滤浓缩液中，继续浓缩，以除去其中的乙酸铵、丙酮。8)超滤过滤，纳滤浓缩取上步浓缩液加入2～3倍注射用水进行稀释，用0.5mol/L的氢氧化钠溶液调节pH值至6.5～7.0，超滤膜(截留分子量为10kDa)过滤，收集透过液，然后用注射用水洗涤剩余液，收集透过液，直至剩余液中替考拉宁全部透过为止。将超滤透过液用0.5mol/L氢氧化钠溶液调节pH值至6.5～7.0，进行纳滤浓缩，直到浓缩液中替考拉宁浓度在50～80g/L时，结束浓缩。9)冻干先在-80℃～-60℃压力低于20Pa的条件下冷冻2～8小时；然后在-60℃～20℃，压力为20～60Pa条件下冻干50～80小时；最后在20℃～30℃，压力低于10Pa的条件下冻干4～10小时即可得到替考拉宁纯品，替考拉宁纯度在99.2％以上。通过本专利技术得到的替考拉宁有效组份得到提高，其它杂质降低，同时产品外观颜色得到明显改观，为制剂的制备提供更优良的原料，减少药物使用过程中的副作用。附图说明图1替考拉宁纯化工艺路线具体实施方式以下结合具体实施例来进一步解释本专利技术，但实施例对专利技术本身不做任何形式的限定。实施例1替考拉宁发酵液25L，发酵液效价3200mg/L，用1mol/L氢氧化钠溶液调pH值至10.8，陶瓷膜过滤，当浓缩至8L时，向陶瓷膜未透过液中加入4L的纯化水，用1mol/L氢氧化钠溶液调节pH值至10.8，搅拌5min，继续陶瓷膜过滤。如此重复以上操作11次，共加入纯化水44L。取样，HPLC检测陶瓷膜透过液中替考拉宁1221mg/L，陶瓷膜过滤结束。共收集陶瓷膜透过液61L，含替考拉宁本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种分离纯化替考拉宁的方法，其特征在于它依次包括如下步骤：1)陶瓷膜过滤替考拉宁发酵液；2)大孔吸附树脂柱层析；3)阳离子交换树脂柱吸附、洗脱；4)洗脱液纳滤浓缩；5)反向层析树脂柱吸附、洗脱；6)活性炭脱色；7)脱色液纳滤浓缩；8)超滤过滤，纳滤浓缩；9)冻干。

【技术特征摘要】
1.一种分离纯化替考拉宁的方法，其特征在于它依次包括如下步骤：1)陶瓷膜过滤替考拉宁发酵液；2)大孔吸附树脂柱层析；3)阳离子交换树脂柱吸附、洗脱；4)洗脱液纳滤浓缩；5)反向层析树脂柱吸附、洗脱；6)活性炭脱色；7)脱色液纳滤浓缩；8)超滤过滤，纳滤浓缩；9)冻干。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)所述陶瓷膜过滤包括：将替考拉宁发酵液用1mol/L氢氧化钠溶液调pH至10.5～11.5，控制料液温度范围20～40℃，进行陶瓷膜过滤。3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)所述大孔吸附树脂柱的树脂型号为HZ818或XAD16，树脂柱径高比1:3～4；优选地，步骤2)具体包括：控制上样流速1～2倍柱体积/小时，上样结束后先用酒精度10％～20％乙醇溶液冲洗树脂柱4-5倍柱体积，然后用酒精度80％～90％乙醇溶液洗脱，流出液颜色变深时，开始收集洗脱液，当洗脱液单位低于600mg/L时洗脱结束，根据HPLC检测结果收集80％～90％乙醇洗脱液。4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3)所述阳离子交换层析的树脂型号D113，树脂柱径高比1:1～2；优选地，步骤3)具体包括：上样流速控制在5～7倍柱体积/小时，上样结束后用纯化水冲洗树脂柱,然后用0.2～0.5mol/L乙酸溶液洗脱，洗脱液单位约1000mg/L时开始收集，0.2～0.5mol/L乙酸继续冲洗，收集洗脱液，直到洗脱液单位低于200mg/L时，结束收集。5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤4)具体包括将步骤3)收集的洗脱液过纳滤膜进行浓缩，控制温度在20～40℃，浓缩至单位20～30g/L时，用纯化水流加入纳滤浓缩液中，继续浓缩，以除去其中的乙酸。6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤5)所述反向层析树脂柱为SKP树脂柱，树脂柱径高比为1:1～2；优...

【专利技术属性】
技术研发人员：张贵民，朱海洋，李春利，
申请(专利权)人：鲁南新时代生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：山东,37