一种用于检测前列腺癌的引物和探针的组合及试剂盒制造技术

本发明专利技术提供一种用于前列腺癌诊断的引物和探针的组合及试剂盒。本发明专利技术针对前列腺癌KLK3基因的外显子区设计了一对特异性Real‑time RCR(qPCR)引物和相应的探针，用该探针可对人血液样本中的循环前列腺癌细胞进行RT‑qPCR检测，根据扩增结果判定人血液样本中是否含有循环的前列腺癌细胞。与常规的前列腺癌诊断方法相比，本发明专利技术的方法具有快速、灵敏和可进行液体活检的优势。

A combination of primers and probes for detection of prostate cancer and kit

The invention provides a combination of a primer and a probe for the diagnosis of prostate cancer and a kit. The present invention for prostate cancer KLK3 gene exon designed a pair of specific Real time RCR (qPCR) primers and the corresponding probe, the probe can be used for RT qPCR detection of human blood samples of circulating prostate cancer cells and prostate cancer cells or human blood samples containing cyclic determination according to the results. Compared with conventional diagnostic methods for prostate cancer, the present method has the advantages of being rapid, sensitive and capable of performing liquid biopsy.

【技术实现步骤摘要】
一种用于检测前列腺癌的引物和探针的组合及试剂盒
本专利技术属于分子生物学领域，涉及医学和生物技术，具体涉及一种用于前列腺癌诊断的引物和探针。
技术介绍
前列腺癌多发于老年男性，发病率在全球男性恶性肿瘤中占第二位，因癌症死亡的男性中，前列腺癌排名第五。年龄、性活动、饮食习惯和家族遗传为前列腺癌发病的主要风险因素。2012年我国肿瘤登记地区前列腺癌发病率为9.92/10万，且发病率逐年上升，并呈年轻化趋势。由于前列腺癌早期没有特异性症状，我国约70％前列腺癌患者发现时已是晚期。因前列腺癌骨转移率较高，自然进展的前列腺癌在利用有效方法临床检测到时通常已经转移。前列腺癌可以通过手术等切除前列腺、睾丸进行治疗，在切除之后由于没有肿瘤组织，检测体内是否还存在癌细胞的难度较大。血管舒缓素相关肽酶3(kallikrein-relatedpeptidase3，KLK3)，也被称作前列腺特异抗原(prostate-specificantigen，PSA)，KLK3基因是人类组织激肽释放酶基因(KLK)家族成员，位于19号染色体上，在前列腺癌组织中呈现高表达，其编码的蛋白是前列腺特异性抗原(PSA)。是临床上广泛用于筛选、诊断前列腺癌的肿瘤标志物。KLK3基因位于19q13.2-q13.4，基因全长6KB，含有5个外显子和4个内含子，转录后的mRNA全长1446bp，转录受雄激素调节。目前，PSA检测、盆腔电子计算机断层扫描(CT)检查、盆腔核磁共振(MRI)检查、直肠超声(TRUS)引导下前列腺穿刺活检等检查是前列腺癌筛查的主要检测手段。对于PSA检测来说，患者血清中存在异常高水平PSA可能是由于癌症、良性前列腺增生或前列腺炎等多种原因导致，在大多数病例中，PSA升高是由于良性前列腺增生或前列腺炎而不是由于癌症；MRI检查在鉴别前列腺癌及伴钙化的前列腺炎、较大的良性前列腺增生、前列腺瘢痕、结核等病变时常无法明确诊断；盆腔CT对于早期前列腺癌的诊断敏感性低于MRI，前列腺癌患者进行CT检查的目的主要是协助临床医师进行肿瘤的临床分期；TRUS引导下的前列腺穿刺活检是目前公认的安全而准确的方法，已成为临床实践中诊断前列腺癌最可靠的检查，但是穿刺活检除了造成患者的创口疼痛外，其术后多种并发症也会给患者带来很大痛苦。外周血循环肿瘤细胞(CTC)的检测是肿瘤患者液体活检的重要手段。当患者体内发生肿瘤时，或者肿瘤复发和转移产生时，瘤块组织中会有大量脱落的肿瘤细胞进入血液循环系统。利用高度灵敏的检测技术，将循环肿瘤细胞检测出来，可以对肿瘤进行早期诊断、复发和转移进行评估。因此，建立新的前列腺癌诊断技术、能够在灵敏准确的确定患者体内是否存在前列腺癌细胞，以便对于诊断患者是否患有前列腺癌和判断患者手术效果来确定最佳治疗方案以提高患者存活率、降低医疗成本是十分必要的。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供一种用于检测人前列腺癌循环肿瘤细胞的特异性引物和探针的组合及包括该引物和探针组合的试剂盒，以及他们的应用及检测方法。本专利技术一方面提供一种人前列腺癌循环肿瘤细胞特异性基因检测的Real-timePCR引物和探针组合，用于人前列腺癌或其复发和转移的分子诊断，另一方面提供一种用于检测人前列腺癌循环肿瘤细胞的试剂盒，同时提供利用本专利技术的Real-timePCR检测试剂盒诊断前列腺癌的方法。本专利技术通过在人前列腺癌循环肿瘤细胞基因组中KLK3基因的启动子区设计一对特异性的Real-timePCR引物和相应的探针，用该引物和探针对待测样本进行RT-qPCR检测，根据扩增结果判定待检样本是否含有人前列腺癌循环肿瘤细胞。本专利技术提供的用于人前列腺癌循环肿瘤细胞检测的特异性引物和探针的组合，其具有如下序列：引物1：5’ATCAGGAACAAAAGCGTGATCT3’(SEQIDNO.1所示)，引物2：5’ATATCGTAGAGCGGGTGTGG3’(SEQIDNO.2所示)，探针：5’ATTTCAGGTCAGCCACAGCT3’(SEQIDNO.3所示)。本专利技术提供的用于检测人前列腺癌的Real-timePCR检测试剂盒，其特征在于包括以上所述的特异性引物和探针的组合。优选的，在本专利技术中所述的试剂盒中还包括10×PCR缓冲液，50mMMgCl2，10μMdNTP以及5U/μlTaq酶。本专利技术还提供了以上所述的特异性引物和探针的组合在制备检测前列腺癌试剂中的应用，以及所述的试剂盒在制备检测前列腺癌患者循环肿瘤细胞试剂中的应用。本专利技术另外还提供了利用Real-timePCR检测试剂盒诊断人前列腺癌的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)血液提取RNA：从待测血液(2.5ml)提取RNA，用DNaseI消化除去基因组DNA。用超微量分光光度计评价RNA的纯度，-80度待用。(2)引物和探针溶液的配制：取18μl引物1(100μM)，18μl引物2(100μM)，5μl探针(100μM)，59μl去离子水。混匀得100μl20×的引物探针混合液(ppmix)。(3)反转录：取1μl上述RNA，加入5×的反应缓冲液2μl，dNTPs[指dATP，dCTP，dGTP，dTTP钠盐的三蒸水溶液，浓度各10mM，pH7.5，纯度＞99％(HPLC)]0.4μl，2×ppmix1μl，反转录酶1μl，双蒸水4.6μl，混匀后反应体系为10μl。(4)预扩增：50℃，30min；95℃，15min；94℃，30s；60℃，2min。最后两步循环14次。(5)荧光定量PCR反应：将上述所得cDNA用去离子水1∶1稀释。取1μlcDNA，加入2×反应缓冲液5μl，20×ppminx0.5μl，ROXdye0.4μl，双蒸水3.1μl。95℃变性2min，95℃，15s；60℃，2min，后两步循环40次。荧光定量检测探针结果，如果在阈值以上出现特异性扩增曲线，结果为阳性；反之，结果为阴性。本专利技术的有益效果体现在：1)特异性：用本专利技术的引物、探针和方法检测人外周血液样本，只有前列腺癌患者或者复发和转移的前列腺癌患者的血液样本出现扩增曲线，显示结果为阳性，而正常人或非前列腺癌患者的外周血样本均未出现扩增曲线，显示结果为阴性。这说明本专利技术有很好的特异性。2)灵敏度：本专利技术的方法可检测到从人2.5ml外周血中所提取的1pg的RNA，说明具有很高的灵敏度。3)高通量：本方法应用荧光定量PCR仪(ABIHT7900)，一次可以同时检测384例样本，从而大量节省了时间，提高了效率。本专利技术建立了一种前列腺癌的分子检测技术，弥补了现有技术的不足，与常规的前列腺癌诊断方法相比，本专利技术的方法具有快速、高通量、灵敏和特异性好等特点，能更好地进行前列腺癌转移和复发的监测。最重要的是，本方法适用于临床液体活检的前列腺癌患者样本，能更好地进行人前列腺癌的早期诊断。附图说明图1为人前列腺癌患者外周血样本(15例)的特异性RT-qPCR检测结果(阈值0.1)；图2为健康人外周血样本(15例)的特异性RT-qPCR检测结果(阈值0.1)。具体实施方式以下通过实施例来进一步描述本专利技术，应该理解的是，这些实施例仅用于例证的目的，绝不限制本专利技术的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，参见《分子克本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于检测前列腺癌的引物和探针的组合，其特征在于所述的引物和探针分别具有如下所示序列：引物1：5’ATCAGGAACAAAAGCGTGATCT3’，引物2：5’ATATCGTAGAGCGGGTGTGG3’，探针：5’ATTTCAGGTCAGCCACAGCT3’。

【技术特征摘要】
1.一种用于检测前列腺癌的引物和探针的组合，其特征在于所述的引物和探针分别具有如下所示序列：引物1：5’ATCAGGAACAAAAGCGTGATCT3’，引物2：5’ATATCGTAGAGCGGGTGTGG3’，探针：5’ATTTCAGGTCAGCCACAGCT3’。2.一种用于检测前列腺癌的Real-timePCR检测试剂盒，其特征在于包括权利要求1所述的引物和探针的组合。3.权利...

【专利技术属性】
技术研发人员：何明芳，李建英，
申请(专利权)人：南京艾莫瑞生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32