一种用于诊断MITF易位性肾癌的分离探针组合及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种用于诊断MITF易位性肾癌的分离探针组合及其应用。一种用于诊断MITF易位性肾癌的分离探针组合，该组合由BAC克隆探针RP11‑26P2和BAC克隆探针RP11‑963H1组成。本发明专利技术根据MITF易位性肾癌的特点，设计结合在MITF基因两端的荧光标记DNA探针组合，在石蜡包埋组织切片的基础上进行原位杂交，检测融合及分离信号，可大大提高诊断该类肿瘤的准确率。采用本发明专利技术提供的探针组合进行检测MITF易位性肾癌，不但方便、快速、可靠而且成功率高，可用于制备MITF易位性肾癌诊断试剂盒，为MITF易位性肾癌的快速准确的诊断提供了新的工具。

A separate probe combination for diagnosis of MITF translocation renal carcinoma and its application

The invention discloses a separate probe combination for diagnosing MITF translocation renal carcinoma and its application. A method for separation of MITF translocation probe combination diagnosis of renal cell carcinoma, the combination of BAC RP11 and BAC 26P2 clone probe probe RP11 963H1 cloning. According to the characteristics of MITF translocation of renal cell carcinoma, combined with the design of the MITF gene in both ends of the combination of fluorescence labeled DNA probe in situ hybridization in paraffin embedded tissue sections based on the detection and separation of signals, which can greatly improve the diagnostic accuracy of the tumor. The invention provides the probe combination detection of MITF translocation RCC, not only convenient, fast, reliable and high success rate, can be used for the preparation of MITF translocation RCC diagnosis kit provides a new tool for the rapid and accurate diagnosis of MITF translocation in renal cell carcinoma.

【技术实现步骤摘要】
一种用于诊断MITF易位性肾癌的分离探针组合及其应用
本专利技术属于荧光原位杂交探针应用领域，涉及一种用于诊断MITF易位性肾癌的分离探针组合及其在制备MITF易位性肾癌诊断试剂中的应用。
技术介绍
2016年新版WHO肾脏肿瘤病理组织学分类新增了一种肾细胞癌类型：MiT家族易位性肾细胞癌。MiT家族是小眼畸形转录因子家族(microphthalmia-associatedtranscriptionfactorfamily)的缩写，该家族成员包括MITF，TFE3、TFEB和TFEC基因。目前已经发现的MiT家族易位性肾细胞癌包括Xp11.2易位/TFE3基因融合相关性肾细胞癌和t(6；11)(p21；q12)易位/TFEB基因融合相关性肾癌。MITF和TFEC基因易位的肿瘤在世界范围内暂无文献报道。MiT家族易位性肾细胞癌致病机理清晰明确，MiT家族成员基因(TFE3/TFEB)的易位是其关键致病因素：这类肿瘤均涉及MiT家族成员基因同其它染色体易位及其所致形成融合基因，通过启动子变换从而高表达TFE3/TFEB融合蛋白，而TFE3/TFEB作为一个转录因子，通过与特异的DNA结构相结合，转录调控体内多种基因表达最终致病。目前至少有10种不同的易位伴侣和融合基因被报道，包括ASPL-TFE3、PRCC-TFE3、SFPQ-TFE3、NONO-TFE3、CLTC-TFE3、LUC7L3-TFE3、KHSRP-TFE3、PARP14-TFE3、DVL2-TFE3、RBM10-TFE3和MALAT1-TFEB等，每例肿瘤内仅存在单一的易位形式。MiT家族易位性肾细胞癌是一罕见类型肿瘤，TFE3基因易位性肾癌约占所有肾细胞癌的1.6％-4％，TFEB基因易位性肾癌相对更加罕见。但该疾病以发病年龄轻为突出特征，占儿童肾细胞癌的40％，且造成极其沉重的家庭及社会负担。此外，有明确证据表明MiT家族易位性肾细胞癌的患者对血管内皮生长因子受体(vascularendothelialgrowthfactorreceptor，VEGFR)或哺乳动物雷帕霉素(mammaliantargetofrapamycin，mTOR)分子靶向治疗敏感。另有研究表明，MET酪氨酸激酶为ASPL-TFE3融合基因的靶基因，并有望成为TFE3易位性肿瘤的治疗靶点。因此，精确诊断此类肿瘤显得十分重要。本专利技术团队通过高通量测序技术，在一例形态学符合MiT家族易位性肾细胞癌特征的病例中检测出PRCC-MITF融合基因，该融合基因型为首次发现，国内外均无报道，且这是国际首次发现MITF基因易位相关性肾细胞癌。由于以往没有针对该基因易位的检测手段，可以猜想，以往的MITF基因易位相关性肾细胞癌都被误诊或漏诊了。目前高通量测序是唯一可以明确未知易位位点的检测手段，然而高通量测序费用高昂，检测周期长，检测平台稀缺，对样品质量要求高，不利于普及推广，对于大多数患者来说也不是首选检测手段。染色体荧光原位杂交(FISH)始于传统的细胞遗传学和DNA技术的结合，快速灵敏、特异性好，可以检测隐匿或微小的染色体畸变以及复杂核型；还可以使用多种荧光标记，显示DNA片段及基因之间的相对位置与方向，空间定位精确。此外，FISH的方法，可以在石蜡包埋的样本上进行回顾性研究，大大降低了对研究样本的要求。目前，利用荧光原位杂交(FISH)诊断该肿瘤的方法国内外均无报道。应用FISH方法检测可有两种探针设计思路，一种是设计MITF基因分离探针，另一种是设计PRCC-MITF基因融合探针。两种设计各有优缺点，融合探针检测结果更精确具体，但由于MITF基因易位肿瘤以往未被发掘，暂时仅本课题组发现了一种易位伴侣(PRCC基因)，不除外MITF易位性肿瘤也和同家族的TFE3一样，具有多样的易位伴侣，因此PRCC-MITF融合探针恐怕不能筛选出所有MITF易位肿瘤。MITF分离探针则弥补这一缺陷，只要MITF基因发生断裂，无论其易位伴侣是哪个基因，MITF分离探针均能检测出阳性结果。
技术实现思路
本专利技术团队通过高通量测序技术，在一例形态学符合MiT家族易位性肾细胞癌特征的病例中检测出PRCC-MITF融合基因,该基因为MITF基因发生断裂并易位至染色体其他位置与所在位置的基因形成的融合基因；具体是由PRCC外显子5和MITF外显子4融合形成。MITF、PRCC基因序列来自GeneBank，序列版本号GRCh38.p7,PRCCtranscript_id＝"XM_005245313.1",MITFtranscript_id＝"NM_198159.2"。融合基因序列为：TGGTCCCCCCCCAGGAAATTGCCCCAGATGCCTCCTTCATCGATGACGAAGCAGGATTTTATAAGTTTGAAGAGCAAAACAGGGCAGAGAGCGAGTGCCCAGGCATGAACACACATTCACGAGCG(SEQIDNO.1)本专利技术针对该MiT家族易位性肾细胞癌的新融合基因设计了诊断MITF易位性肾癌的分离探针组合。一种用于诊断MITF易位性肾癌的分离探针组合，该组合为BAC克隆探针RP11-26P2和BAC克隆探针RP11-963H1。所述的探针组合，其中，BAC克隆探针RP11-26P2定位于MITF着丝粒一侧，标记为任意一种颜色的荧光；BAC克隆探针RP11-963H1定位于MITF端粒一侧，标记为与着丝粒一侧标记的颜色不同的荧光。所述的分离探针组合，其中RP11-26P2优选标记为绿色荧光，RP11-963H1优选标记为红色荧光；标记的荧光颜色可以互换。本专利技术所述的探针在制备MITF易位性肾癌诊断试剂中的应用。一种MITF易位性肾癌诊断试剂盒，包含本专利技术所述的探针组合。以下是本专利技术技术方案详细的说明：本专利技术中，MITF着丝粒一侧BAC克隆片段为RP11-26P2(片段长度163kb),MITF端粒一侧BAC克隆片段为RP11-963H1(片段长度196kb)，这些片段为细菌人工染色体(Bacterialartificialchromosome，BAC)克隆，其在人类染色体上的定位已经公开，分别为RP11-26P2，定位于3号染色体69542872-69705988和RP11-963H1，定位于3号染色体70151790-70348243。MITF基因的定位为3号染色体69788586-70017488。BAC克隆片段与MITF基因的链接顺序为RP11-26P2，MITF，RP11-963H1。MITF基因与染色体上结合的BAC克隆片段之间保持一定距离而不会重叠(本专利技术中最大为134kb，最小为83kb)，因而MITF基因内部的断裂重排不会影响BAC克隆片段与染色体相应位置结合。这样，由于采用的BAC克隆片段大小相近(本专利技术中两个探针相差仅为33kb)，两端BAC克隆片段之间最远距离控制在1500kb以内，彼此之间存在适当的间隔，使得在进行荧光观察时，端粒侧BAC克隆片段显示一种荧光，如红色，着丝粒侧BAC克隆片段显示另一种荧光，如绿色，在非MITF易位性肾癌时，MITF基因不断裂，红绿两种荧光靠得比较近，观察时出现红绿融合信号(表现为红绿相连或黄色信号点)，而在MI本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于诊断MITF易位性肾癌的分离探针组合，其特征在于该组合由BAC克隆探针RP11‑26P2和BAC克隆探针RP11‑963H1组成；所述的MITF易位性肾癌其致病基因为MITF基因发生断裂并易位至染色体其他位置与所在位置的基因形成的融合基因。

【技术特征摘要】
1.一种用于诊断MITF易位性肾癌的分离探针组合，其特征在于该组合由BAC克隆探针RP11-26P2和BAC克隆探针RP11-963H1组成；所述的MITF易位性肾癌其致病基因为MITF基因发生断裂并易位至染色体其他位置与所在位置的基因形成的融合基因。2.根据权利要求1所述的探针组合，其特征在于所述的BAC克隆探针RP11-26P2定位于MITF着丝粒一侧，标记为任意一种颜色的荧光；所述的BAC克隆探针RP11-963H1...

【专利技术属性】
技术研发人员：饶秋，夏秋媛，魏雪，王璇，李芳秋，周晓军，
申请(专利权)人：中国人民解放军南京军区南京总医院，
类型：发明
国别省市：江苏,32