青霉素扩环酶突变体、编码该突变体的DNA、含有该突变体的试剂盒及其应用制造技术

本发明专利技术提供了青霉素扩环酶突变体、编码该突变体的DNA、含有该突变体的试剂盒及其应用。所述青霉素扩环酶突变体的氨基酸序列以序列表中的SEQ ID NO.:2为参考序列，具有位于第42位苏氨酸和第126位谷氨酰胺中的至少一者的突变，所述第42位苏氨酸突变为除其自身以外其他天然氨基酸中的任一者，所述第126位谷氨酰胺突变为除其自身以外其他天然氨基酸中的任一者。本发明专利技术的青霉素扩环酶突变体具有提高的催化活性和耐热性，更适于商业和工业应用。

Penicillin ring enzyme mutant, DNA encoding the mutant, kit containing the mutant and its application

The present invention provides a penicillin ring enzyme mutant, a DNA encoding the mutant, a kit containing the mutant and its application. The amino acid sequence of the penicillin expandase mutant sequence to the list of SEQ ID NO.: 2 as the reference sequence, with the mutation at position forty-second and 126th threonine glutamine in at least one of the forty-second threonine mutation for any other than its own natural amino acid in the. The 126th Gln mutant except its own for any other natural amino acids in the. The mutant has the advantages of improved catalytic activity and heat resistance, and is more suitable for commercial and industrial application.

【技术实现步骤摘要】
青霉素扩环酶突变体、编码该突变体的DNA、含有该突变体的试剂盒及其应用
本专利技术属于基因工程
，具体而言，涉及青霉素扩环酶突变体、编码该突变体的DNA、含有该突变体的试剂盒及其应用。
技术介绍
β-内酰胺类抗生素是临床使用最多和应用最广的一类抗生素。β-内酰胺环抗生素中最主要的两类是青霉素和头孢类抗生素。青霉素因其高效和低毒而成为临床上应用最广的重要抗生素。但是随着青霉素的大量使用，它的一些不足也暴露出来，如青霉素抗菌谱相对比较窄、容易导致病菌耐药性、对酸不稳定、不能口服等。头孢菌素和青霉素都具有β-内酰胺特征，两者的不同之处是青霉素的母核由β-内酰胺环和五元噻唑环构成，而头孢菌素的母核则由β-内酰胺环和六元二氢噻嗪环构成。因此，头孢菌素不易被β-内酰胺酶(如金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)的β-内酰胺酶)降解。而且头孢菌素具有高效、低毒、抗菌谱广、过敏反应少、可以口服、品种多等优点。头孢菌素作为一类广谱半合成抗生素，可分为以7-氨基-3-去乙酰氧基头孢烷酸(7-ADCA)为母核和以7-氨基头孢烷酸(7-ACA)为母核的两大系列。以7-ADCA为母核的系列是青霉素的下游产品。利用7-ADCA可以进一步合成头孢氨苄、头孢拉定等头孢菌素类抗生素药物。目前，工业上从青霉素G到7-ADCA的合成使用化学法，反应条件苛刻，步骤繁琐，对环境造成污染。而使用青霉素扩环酶使青霉素G扩环从而得到G-7-ADCA(7-苯乙酰基脱乙酰氧基头孢菌素)是更为有效和环保的方法。因此，青霉素扩环酶成为当今工业酶研究中的一大热点。但青霉素扩环酶的天然底物是不易廉价取得的青霉素N。非天然底物青霉素G则可以方便、廉价地获得。所以科学家们利用各种方法对青霉素扩环酶进行改造，以提高它对非天然性底物青霉素G的催化活性。自1976年Kohsaka首先对低等真核生物顶头孢菌的扩环酶进行研究以来，至今扩环酶的研究得到迅速发展。以棒状链霉菌(Streptomycesclavuligerus)为来源的扩环酶由于具有潜在的工业应用价值而得到研究者的极大关注。然而，仍需要对青霉素G的催化活性和耐热性提高的青霉素扩环酶。
技术实现思路
为解决上述现有技术中所存在的问题，本专利技术提供了青霉素扩环酶突变体、编码该突变体的DNA、含有该突变体的试剂盒及其应用。具体而言，本专利技术提供了：(1)一种青霉素扩环酶突变体，其特征在于其氨基酸序列以序列表中的SEQIDNO.:2为参考序列，具有位于第42位苏氨酸和第126位谷氨酰胺中的至少一者的突变，所述第42位苏氨酸突变为除其自身以外其他天然氨基酸中的任一者，所述第126位谷氨酰胺突变为除其自身以外其他天然氨基酸中的任一者。(2)根据(1)所述的青霉素扩环酶突变体，其特征在于其具有位于第42位苏氨酸的所述突变和位于第126位谷氨酰胺的所述突变。(3)根据(1)或(2)所述的青霉素扩环酶突变体，其特征在于所述第42位苏氨酸突变为半胱氨酸、或天冬氨酸、或谷氨酸、或蛋氨酸、或脯氨酸、或谷氨酰胺、或精氨酸。(4)根据(1)或(2)所述的青霉素扩环酶突变体，其特征在于所述第42位苏氨酸突变为天冬氨酸。(5)根据(1)或(2)所述的青霉素扩环酶突变体，其特征在于所述第126位谷氨酰胺突变为丙氨酸、或苯丙氨酸、或异亮氨酸、或亮氨酸、或蛋氨酸、或天冬酰胺、或色氨酸、或酪氨酸。(6)根据(1)或(2)所述的青霉素扩环酶突变体，其特征在于所述第126位谷氨酰胺突变为苯丙氨酸。(7)根据(1)所述的青霉素扩环酶突变体，其特征在于其具有序列表中的SEQIDNO.:4所示的氨基酸序列，并且其中第42位的Xaa代表半胱氨酸、或天冬氨酸、或谷氨酸、或蛋氨酸、或脯氨酸、或谷氨酰胺、或精氨酸。(8)根据(1)所述的青霉素扩环酶突变体，其特征在于其具有序列表中的SEQIDNO.:4所示的氨基酸序列，并且其中第126位的Xaa代表丙氨酸、或苯丙氨酸、或异亮氨酸、或亮氨酸、或蛋氨酸、或天冬酰胺、或色氨酸、或酪氨酸。(9)根据(1)所述的青霉素扩环酶突变体，其特征在于其具有序列表中的SEQIDNO.:4所示的氨基酸序列，其中第42位的Xaa代表天冬氨酸，并且第126位的Xaa代表苯丙氨酸。(10)一种DNA，其含有编码(1)至(9)中任一项所述的青霉素扩环酶突变体的核苷酸序列。(11)一种表达载体，其含有与启动子有效连接的(10)所述的DNA。(12)一种宿主细胞，其含有(11)所述的表达载体。(13)(1)至(9)中任一项所述的青霉素扩环酶突变体在制备7-苯乙酰基脱乙酰氧基头孢菌素中的应用。(14)根据(13)所述的应用，其中所述青霉素扩环酶突变体以青霉素G为底物。(15)一种制备7-苯乙酰基脱乙酰氧基头孢菌素的方法，包括将(1)至(9)中任一项所述的青霉素扩环酶突变体与用于制备7-苯乙酰基脱乙酰氧基头孢菌素的底物一起孵育。(16)根据(15)所述的方法，其中所述底物为青霉素G。(17)一种用于制备7-苯乙酰基脱乙酰氧基头孢菌素的试剂盒，包含(1)至(9)中任一项所述的青霉素扩环酶突变体。(18)根据(17)所述的试剂盒，还包含青霉素G。本专利技术与现有技术相比具有以下优点和积极效果：本专利技术通过对棒状链霉菌的青霉素扩环酶进行基因工程改造，提高了该酶对青霉素G的催化活性和耐热性。与野生型青霉素扩环酶相比，本专利技术的青霉素扩环酶突变体的催化活性可提高至少20％，耐热性可提高至少400％。本专利技术的青霉素扩环酶突变体更适于商业和工业应用。具体实施方式以下通过具体实施方式的描述对本专利技术作进一步说明，但这并非是对本专利技术的限制，本领域技术人员根据本专利技术的基本思想，可以做出各种修改或改进，但是只要不脱离本专利技术的基本思想，均在本专利技术的范围之内。为了解决上述现有技术中存在的问题，本专利技术的专利技术人进行了大量深入的理论研究和实验摸索，利用遗传工程和蛋白质工程技术，对棒状链霉菌的青霉素扩环酶进行了突变改造，最终获得了一系列具有高酶活和高耐热性的青霉素扩环酶突变体，可更有利地用于生产G-7-ADCA。具体而言，本专利技术提供了一种青霉素扩环酶突变体，其特征在于其氨基酸序列以序列表中的SEQIDNO.:2为参考序列，具有位于第42位苏氨酸和第126位谷氨酰胺中的至少一者的突变，所述第42位苏氨酸突变为除其自身以外其他天然氨基酸中的任一者，所述第126位谷氨酰胺突变为除其自身以外其他天然氨基酸中的任一者。优选地，所述第42位苏氨酸突变为半胱氨酸、或天冬氨酸、或谷氨酸、或蛋氨酸(Met)、或脯氨酸、或谷氨酰胺、或精氨酸；其中更优选突变为天冬氨酸、谷氨酸、蛋氨酸或谷氨酰胺，最优选突变为天冬氨酸。优选地，所述第126位谷氨酰胺突变为丙氨酸、或苯丙氨酸、或异亮氨酸、或亮氨酸、或蛋氨酸、或天冬酰胺、或色氨酸、或酪氨酸；其中更优选突变为苯丙氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸、或酪氨酸，最优选突变为苯丙氨酸。优选地，所述青霉素扩环酶突变体同时具有位于第42位苏氨酸的突变和位于第126位谷氨酰胺的突变。优选地，所述青霉素扩环酶突变体具有序列表中的SEQIDNO.:4所示的氨基酸序列。编码序列表SEQIDNO.:4所示的氨基酸序列的核苷酸序列如SEQIDNO.:3所示。还优选地，序列表SEQ本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种青霉素扩环酶突变体，其特征在于其氨基酸序列以序列表中的SEQ ID NO.:2为参考序列，具有位于第42位苏氨酸和第126位谷氨酰胺中的至少一者的突变，所述第42位苏氨酸突变为除其自身以外其他天然氨基酸中的任一者，所述第126位谷氨酰胺突变为除其自身以外其他天然氨基酸中的任一者。

【技术特征摘要】
1.一种青霉素扩环酶突变体，其特征在于其氨基酸序列以序列表中的SEQIDNO.:2为参考序列，具有位于第42位苏氨酸和第126位谷氨酰胺中的至少一者的突变，所述第42位苏氨酸突变为除其自身以外其他天然氨基酸中的任一者，所述第126位谷氨酰胺突变为除其自身以外其他天然氨基酸中的任一者。2.根据权利要求1所述的青霉素扩环酶突变体，其特征在于其具有位于第42位苏氨酸的所述突变和位于第126位谷氨酰胺的所述突变。3.根据权利要求1或2所述的青霉素扩环酶突变体，其特征在于所述第42位苏氨酸突变为半胱氨酸、或天冬氨酸、或谷氨酸、或蛋氨酸、或脯氨酸、或谷氨酰胺、或精氨酸。4.根据权利要求1或2所述的青霉素扩环酶突变体，其特征在于所述第42位苏氨酸突变为天冬氨酸。5.根据权利要求1或2所述的青霉素扩环酶突变体，其特征在于所述第126位谷氨酰胺突变为丙氨酸、或苯丙氨酸、或异亮氨酸、或亮氨酸、或蛋氨酸、或天冬酰胺、或色氨酸、或酪氨酸。6.根据权利要求1或2所述的青霉素扩环酶突变体，其特征在于所述第126位谷氨酰胺突变为苯丙氨酸。7.根据权利要求1所述的青霉素扩环酶突变体，其特征在于其具有序列表中的SEQIDNO.:4所示的氨基酸序列，并且其中第42位的Xaa代表半胱氨酸、或天冬氨酸、或谷氨酸、或蛋氨酸、或脯氨酸、或谷氨酰胺、或精氨酸。8.根据权利要求1...

【专利技术属性】
技术研发人员：吕旭新，郑绍明，萧游龙，王骏，
申请(专利权)人：百瑞全球有限公司，
类型：发明
国别省市：英国,GB