The present invention discloses a method for purifying thioredoxin by metal chelate affinity chromatography. The invention of the thioredoxin recombinant plasmid expressed in Escherichia coli, adding cell lysate, centrifuged to remove cellular debris, agarose gel microspheres carboxymethylated aspartic acidification immobilized metal ion buffer solution added with good balance of cobalt in the supernatant, fully after incubation, centrifugation, medium in microspheres after centrifugation by eluent gradient elution, after leaching into the buffer solution with sufficient imidazole elution, collecting the eluent. This method is realized by metal chelate affinity chromatography gradient elution purification of thioredoxin, the target protein has high adsorption capacity, high product purity, mild elution conditions, low cost, simple operation and high efficiency, suitable for large scale application.
【技术实现步骤摘要】
一种金属螯合亲和色谱纯化硫氧还蛋白的方法
本专利技术涉及生物医药材料制备
,尤其涉及一种采用金属螯合亲和色谱纯化硫氧还蛋白的高效制备方法。
技术介绍
硫氧还蛋白(Thioredoxin,Trx)是一类高度保守的紧密球形蛋白,由100余个氨基酸残基,形成一个“TRX折叠”的稳定三维结构,广泛分布于各种生物体内。Trx是一个具有氧化还原作用的小分子功能性蛋白,相对分子质量约12kDa,含有一个保守的氧化还原活性位点Cys-Gly-Pro-Cys,其中的两个Cys残基能够通过转移电子还原其他含二硫键的蛋白质,可逆催化许多氧化还原反应,赋予Trx独特的生物学特性,使得生物体内的一系列生理反应得以顺利进行。Trx具有抗氧化、抗炎症、抗过敏和抗衰老等多种功能,可以调节细胞生长、抑制细胞凋亡、调节基因转录等,对维持生物体内稳定的氧化还原状态具有重要的作用。此外,Trx与植物抗逆性相关,在植物遗传性状改良等方面具有广泛的应用前景,如参与植物抗旱、耐热和抗氧化胁迫过程,调节抗逆基因的表达等。1964年,Reichard等首次发现在大肠杆菌中,Trx作为核苷酸还原酶的供体参与DNA的合成。大肠杆菌的Trx结构是一种结合紧密的球形蛋白质,由5个β折叠构成一个疏水核心,核心的终末端被4个α螺旋包绕。在酵母中,Trx是DNA快速复制的重要保障。酵母细胞溶质的硫氧还蛋白系统与大肠杆菌的相似,在细菌和酵母菌中,Trx作为PAPS将硫酸盐还原为亚硫酸盐,完成了硫的同化。在人体中,硫氧还蛋白又称为成人T细胞白血病衍生因子,与NADPH和硫氧还蛋白还原酶共同组成Trx还原系统,对维持体 ...
【技术保护点】
一种金属螯合亲和色谱纯化硫氧还蛋白的方法,其特征在于,包括如下步骤:(1)将硫氧还蛋白重组质粒(其基因序列如SEQ ID NO.1所示)置于大肠杆菌的细胞中,得菌液;在LB细胞培养液(含有卡那霉素25μg/mL和100μg/mL腺苷一磷酸,溶剂为水)中培养细胞(菌液与细胞培养液体积比为1:100),使重组质粒表达完成,之后细胞经预冷到4℃的PBS溶液和室温下的双蒸水分别冲洗若干次,加入细胞裂解液,细胞裂解液的加入量与细胞培养液的体积比为1:1~1:20,摇动至溶液成透明状,6000~16000r/min下离心5~60min,去除细胞碎片,分离上清液及菌沉淀,在上清液中加入用缓冲溶液平衡好的固定金属离子的羧甲基天冬氨酸化的琼脂糖凝胶微球,固定金属离子的物质的量与细胞培养液的体积的比例为1:1~1:20(mol:mL),孵育5~80min后,离心分离。(2)在离心后余下的微球介质中采用淋洗液(含有NaCl的缓冲溶液)进行梯度淋洗,采用的梯度淋洗方法为:NaCl浓度在0mol/L到0.05mol/L范围内以6mL/min的速度进行线性梯度洗脱),淋洗之后再采用含有20~400mM咪唑的缓冲溶 ...
【技术特征摘要】
1.一种金属螯合亲和色谱纯化硫氧还蛋白的方法,其特征在于,包括如下步骤:(1)将硫氧还蛋白重组质粒(其基因序列如SEQIDNO.1所示)置于大肠杆菌的细胞中,得菌液;在LB细胞培养液(含有卡那霉素25μg/mL和100μg/mL腺苷一磷酸,溶剂为水)中培养细胞(菌液与细胞培养液体积比为1:100),使重组质粒表达完成,之后细胞经预冷到4℃的PBS溶液和室温下的双蒸水分别冲洗若干次,加入细胞裂解液,细胞裂解液的加入量与细胞培养液的体积比为1:1~1:20,摇动至溶液成透明状,6000~16000r/min下离心5~60min,去除细胞碎片,分离上清液及菌沉淀,在上清液中加入用缓冲溶液平衡好的固定金属离子的羧甲基天冬氨酸化的琼脂糖凝胶微球,固定金属离子的物质的量与细胞培养液的体积的比例为1:1~1:20(mol:mL),孵育5~80min后,离心分离。(2)在离心后余下的微球介质中采用淋洗液(含有NaCl的缓冲溶液)进行梯度淋洗,采用的梯度淋洗方法为:NaCl浓度在0mol/L到0.05mol/L范围内以6mL/min的速度进行线性梯度洗脱),淋洗之后再采用含有20~400mM咪唑的缓冲溶液进行充分洗脱,收集洗脱液,得到金属螯合亲和色谱纯化硫氧还蛋白。2.根据权利要求1所述的一种金属螯合亲和色谱纯化硫氧还蛋白的方法,其...
【专利技术属性】
技术研发人员:李大伟,周光大,林建华,
申请(专利权)人:浙江福斯特新材料研究院有限公司,
类型:发明
国别省市:浙江,33
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。