一种二氢硫辛酰胺脱氢酶突变体蛋白及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种二氢硫辛酰胺脱氢酶突变体蛋白及其制备方法和应用。本发明专利技术提供了一种蛋白质(IAA350/351/358VVV突变体蛋白)，为将二氢硫辛酰胺脱氢酶进行点突变甲和点突变乙和点突变丙得到的蛋白质；点突变甲为将二氢硫辛酰胺脱氢酶第350位氨基酸残基由I突变为V；点突变乙为将二氢硫辛酰胺脱氢酶第351位氨基酸残基由A突变为V；点突变丙为将二氢硫辛酰胺脱氢酶第358位氨基酸残基由A突变为V。本发明专利技术提供的突变体蛋白，对NADH抑制的敏感性降低，使得PDH在厌氧大肠杆菌培养物中对NADH的耐受性增加，能有效提高PDH的活性。本发明专利技术对于大肠杆菌生产琥珀酸盐、乙醇、丁醇、1,3‑丙二醇等还原化学物质具有广泛的应用前景。

A mutant protein of two hydrogen sulfide dehydrogenase dehydrogenase and its preparation and Application

The invention discloses a two hydrogen sulfide dehydrogenase dehydrogenase mutant protein, and its preparation method and application. The present invention provides a protein (IAA350/351/358VVV mutant protein), for the two dihydrolipoamide dehydrogenase gene mutations and point mutations of a B and C get point mutation protein; point mutation is a two dihydrolipoamide dehydrogenase 350th amino acid residues mutated from I to V; point mutation for B two dihydrolipoamide dehydrogenase 351st amino acid residues mutated from A to V; point mutation of C for two dihydrolipoamide dehydrogenase 358th amino acid residues mutated from A to V. The mutant protein provided by this invention has a lower sensitivity to NADH inhibition, which increases the tolerance of PDH to NADH in anaerobic Escherichia coli culture, and effectively improves the activity of PDH. The invention has wide application prospect for the reduction of chemical production by Escherichia coli succinate, ethanol, butanol, 1,3 propylene glycol.

【技术实现步骤摘要】
一种二氢硫辛酰胺脱氢酶突变体蛋白及其制备方法和应用
本专利技术涉及一种二氢硫辛酰胺脱氢酶突变体蛋白及其制备方法和应用。
技术介绍
大肠杆菌，兼性异养，在有氧和无氧条件下均能生长。丙酮酸脱氢酶(PDH)又称丙酮酸脱氢酶复合物(PDHC)，位于线粒体中，控制着碳水化合物利用的关键步骤，即丙酮酸转化为乙酰辅酶A和NADH。PDH的三个组分由单个操纵子编码，该操纵子包括调节基因(pdhR)和三个结构基因，三个结构基因为aceE基因(编码丙酮酸脱氢酶E1)、aceF基因(编码二氢硫辛酰胺乙酰转移酶E2)和lpd基因(编码二氢硫辛酰胺脱氢酶E3)。在厌氧条件下，大肠杆菌的细胞提取物中能检测到PDH活性，然而，大肠杆菌体内的PDH通常是无活性的。在有氧生长期间，糖酵解中产生的NADH最终被氧化，而在糖酵解过程中由葡萄糖产生的有机化合物用作电子受体，以维持氧化还原平衡，并且在厌氧条件下持续细菌的生长。由于两种生长模式之间的电子受体的差异，厌氧细胞所报导的[NADH]/[NAD+]比值远高于好氧细胞的比值。由于NADH的抑制，厌氧大肠杆菌培养物中的PDH活性非常低或检测不到其活性。进一步的研究已经证实，PDH的NADH敏感性位于二氢硫辛酰胺脱氢酶(Dihydrolipoamidedehydrogenase,Lpd)中，因为只有这种酶与NAD+作为底物相互作用。工业发酵旨在有氧或厌氧的条件下，微生物利用便宜的原料生产有价值的产品。在厌氧发酵过程中，还原力NADH主要集中于产物的合成而不是被氧化，从而导致目标产物产量更高。例如，乳酸和琥珀酸等有机酸，二者均能通过厌氧发酵有效地产生。然而，乳酸和琥珀酸的最大理论得率均受NADH供应的限制。这是因为：在厌氧条件下，由于PDH的活力受到抑制，1摩尔的葡萄糖经糖酵解途径仅能提供2摩尔的NADH；然而在好氧条件下，1摩尔的葡萄糖可以产生4摩尔的NADH。可见，足够还原力的供应对于获得目标产物的最大理论得率是至关重要的。PDH催化丙酮酸转化为乙酰辅酶A，同时伴随一分子NADH的生成。如果PDH酶被激活，NADH的可利用度就可以得到改善，导致代谢通路中NADH依赖型的产品的产量增加。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种二氢硫辛酰胺脱氢酶突变体蛋白及其制备方法和应用。本专利技术提供了一种蛋白质(IAA350/351/358VVV突变体蛋白)，为如下(a1)或(a2)：(a1)将二氢硫辛酰胺脱氢酶进行点突变甲和点突变乙和点突变丙得到的蛋白质；所述点突变甲为将二氢硫辛酰胺脱氢酶第350位氨基酸残基由I突变为V；所述点突变乙为将二氢硫辛酰胺脱氢酶第351位氨基酸残基由A突变为V；所述点突变丙为将二氢硫辛酰胺脱氢酶第358位氨基酸残基由A突变为V；(a2)在(a1)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质。所述标签见表1。表1标签的序列标签残基序列Poly-Arg5-6(通常为5个)RRRRRPoly-His2-10(通常为6个)HHHHHHFLAG8DYKDDDDKStrep-tagII8WSHPQFEKc-myc10EQKLISEEDL所述二氢硫辛酰胺脱氢酶为如下(b1)或(b2)或(b3)：(b1)序列表的序列1所示的蛋白质；(b2)来源于大肠杆菌且与序列表的序列1所示的蛋白质具有90％以上同一性的蛋白质；(b3)来源于大肠杆菌且与序列表的序列1所示的蛋白质具有90％以上同一性且具有二氢硫辛酰胺脱氢酶功能的蛋白质。所述大肠杆菌具体可为大肠杆菌MG1655。编码IAA350/351/358VVV突变体蛋白的基因也属于本专利技术的保护范围。所述基因为将序列表的序列2所示DNA分子进行如下突变得到的DNA分子：第1048-1053位核苷酸由“ATCGCC”突变为了“GTTGTT”，并且，第1072-1074位核苷酸由“GCA”突变为了“GTT”。含有所述基因的表达盒、重组载体、转基因细胞系或重组菌均属于本专利技术的保护范围。所述重组载体具体可为在pET-28a(+)质粒的多克隆位点(例如BamHI和XhoI酶切位点之间)插入序列表的序列2所示的DNA分子得到的重组质粒。所述重组菌具体可为将以上任一所述重组载体导入出发菌得到的重组菌。所述出发菌可为大肠杆菌，具体可为大肠杆菌BL21(DE3)。本专利技术还保护IAA350/351/358VVV突变体蛋白作为二氢硫辛酰胺脱氢酶的应用。本专利技术还保护一种丙酮酸脱氢酶复合物，其特征在于：用IAA350/351/358VVV突变体蛋白代替了丙酮酸脱氢酶复合物中的二氢硫辛酰胺脱氢酶。本专利技术还保护所述丙酮酸脱氢酶复合物作为丙酮酸脱氢酶复合物的应用。本专利技术还保护一种制备IAA350/351/358VVV突变体蛋白的方法，包括发酵所述重组菌的步骤。本专利技术还保护一种解除二氢硫辛酰胺脱氢酶受NADH抑制的方法，包括如下步骤：将二氢硫辛酰胺脱氢酶进行点突变甲和点突变乙和点突变丙；所述点突变甲为将二氢硫辛酰胺脱氢酶第350位氨基酸残基由I突变为V；所述点突变乙为将二氢硫辛酰胺脱氢酶第351位氨基酸残基由A突变为V；所述点突变丙为将二氢硫辛酰胺脱氢酶第358位氨基酸残基由A突变为V。为了获得厌氧条件下目标产品的最大产量，微生物必须提供足够的还原当量。丙酮酸脱氢酶催化丙酮酸转化为乙酰辅酶A，同时伴随一分子NADH的生成。然而在厌氧条件下，由于二氢硫辛酰胺脱氢酶受NADH的抑制，大肠杆菌的PDH通常是没有活性的。本专利技术的专利技术人通过大量序列分析、结构分析建立了容量庞大的突变蛋白库，对多个单点突变蛋白和多点突变蛋白的酶活进行比较，寻找可以消除NADH对LPD的抑制作用(进而消除NADH对PDH的抑制)的关键的突变点，发现了一个三点突变的突变体蛋白(IAA350/351/358VVV)。与野生型蛋白以及其他突变体蛋白相比，突变体蛋白(IAA350/351/358VVV)能更有效的提高厌氧条件下PDH的活力，降低PDH对NADH抑制的敏感性。即使存在较高水平的NADH，突变体蛋白IAA350/351/358VVV也是有活性的。突变体蛋白IAA350/351/358VVV的PDH活性在NADH]/[NAD+]比为0.15时是A358V突变体的6倍以上。据报道，在需氧条件下生长的大肠杆菌的细胞内[NADH]/[NAD+]比约为0.03至0.05。在这个比例下，PDH复合物保留了最大活性的几乎90％。预计厌氧细胞的[NADH]/[NAD+]比值将高于需氧细胞的浓度值得注意的是，在添加[NADH]/[NAD+]比为0.15的条件下，突变体蛋白IAA350/351/358VVV的PDH的活性仍然高于没有任何NADH添加的野生型蛋白PDH的活性。本专利技术提供的突变体蛋白(IAA350/351/358VVV)，对NADH抑制的敏感性降低，使得PDH在厌氧大肠杆菌培养物中对NADH的耐受性增加，能有效提高PDH的活性。本专利技术对于大肠杆菌生产琥珀酸盐、乙醇、丁醇、1,3-丙二醇等还原化学物质具有广泛的应用前景。附图说明图1为实施例2的结果。图2为实施例3的结果。具体实施方式以下的实施例便于更好地理解本专利技术，但并不限定本专利技术。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种蛋白质，为如下(a1)或(a2)：(a1)将二氢硫辛酰胺脱氢酶进行点突变甲和点突变乙和点突变丙得到的蛋白质；所述点突变甲为将二氢硫辛酰胺脱氢酶第350位氨基酸残基由I突变为V；所述点突变乙为将二氢硫辛酰胺脱氢酶第351位氨基酸残基由A突变为V；所述点突变丙为将二氢硫辛酰胺脱氢酶第358位氨基酸残基由A突变为V；(a2)在(a1)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质。

【技术特征摘要】
1.一种蛋白质，为如下(a1)或(a2)：(a1)将二氢硫辛酰胺脱氢酶进行点突变甲和点突变乙和点突变丙得到的蛋白质；所述点突变甲为将二氢硫辛酰胺脱氢酶第350位氨基酸残基由I突变为V；所述点突变乙为将二氢硫辛酰胺脱氢酶第351位氨基酸残基由A突变为V；所述点突变丙为将二氢硫辛酰胺脱氢酶第358位氨基酸残基由A突变为V；(a2)在(a1)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质。2.如权利要求1所述的蛋白质，其特征在于：所述二氢硫辛酰胺脱氢酶为如下(b1)或(b2)或(b3)：(b1)序列表的序列1所示的蛋白质；(b2)来源于大肠杆菌且与序列表的序列1所示的蛋白质具有90％以上同一性的蛋白质；(b3)来源于大肠杆菌且与序列表的序列1所示的蛋白质具有90％以上同一性且具有二氢硫辛酰胺脱氢酶功能的蛋白质。3.编码权利要求1或2所述蛋白质的基因。4.如权利要求3所述的基因，其特征在于：所述基因为将序列表的序列2所示DNA分子进行如下突变得到的DNA分子：第1048...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈晶瑜，孟娇，
申请(专利权)人：中国农业大学，
类型：发明
国别省市：北京,11