一种茄子细胞色素P450基因StCYP84A及其获得方法和应用技术

本发明专利技术提供一种茄子细胞色素P450基因StCYP84A及其获得方法和应用。该基因具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；该基因获得方法包括以下步骤：1)提取水茄样本总RNA和基因组DNA；2)以步骤1)中所提取RNA反转录成的cDNA为模板，设计特异引物进行RACE‑PCR扩增；对步骤2)中所获得的PCR产物进行回收、测序与序列分析。所述茄子细胞色素P450基因StCYP84A以及编码相关蛋白可用于抗黄萎病，进一步可应用于植物分子标记辅助育种和基因工程领域进行遗传性状的改良。本发明专利技术的基因对培育植物抗逆品种，特别是抗黄萎病茄子品种提高作物产量和品质具有重要意义。

Eggplant cytochrome P450 gene StCYP84A and its obtaining method and Application

The present invention provides a eggplant cytochrome P450 gene StCYP84A and its obtaining method and application. This gene has a nucleotide sequence of SEQ ID NO.1 shown; the gene method comprises the following steps: 1) extracting water samples of eggplant total RNA and genomic DNA; 2) to step 1) in RNA extracted by reverse transcription into cDNA as template, specific primers were designed for PCR amplification of RACE steps; 2) PCR products obtained by analysis and sequencing, recovery. The eggplant cytochrome P450 gene StCYP84A and coding related proteins can be used for Verticillium wilt resistance, and further can be applied to plant genetic marker assisted breeding and genetic engineering to improve genetic traits. The gene of the invention is of great significance to the cultivation of plant resistant varieties, especially to Verticillium wilt resistant eggplant varieties, and to improve the yield and quality of crops.

【技术实现步骤摘要】
一种茄子细胞色素P450基因StCYP84A及其获得方法和应用
本专利技术涉及分子生物学和农业领域，具体涉及一种茄子抗黄萎病细胞色素P450基因的获得方法及其应用。
技术介绍
茄子(SolanummelongenaL.)是我国重要蔬菜之一，营养丰富，经济效益较高，但大多数栽培茄易受黄萎病侵染。茄子黄萎病是由轮枝菌引起的一种土传性维管束病害，其症状通常表现为植株半边或叶片半边发黄、萎蔫，发病严重时劈开茎秆，可见维管束变褐。该病潜伏期长，传播能力强，为害范围广。发病严重时产量损失可达60％以上，美国、日本和印度都曾爆发茄子黄萎病，造成大面积减产。针对茄子黄萎病的防治，目前生产中多采用化学药剂、轮作等方法，但由于农药污染、经济成本等方面的矛盾，这些防治方法的实际应用效果不佳。P450基因(细胞色素P450家族基因)在植物防御反应中发挥了非常重要的作用，广泛参与植保素的合成、激素代谢及大量次生代谢物的合成过程。如拟南芥植保素的生物合成涉及5个P450酶：CYP79B2、CYP79B3、CYP71A12、CYP71A13和CYP71B15。此外，拟南芥P450家族中12个基因特异受到A.brassicicola(芸薹链格孢)的诱导表达，5个受到A.alternata(链格孢)的诱导表达。拟南芥中超量表达CaCYP450A还能增强对假单胞杆菌(Pst)和活体营养型卵菌的抗性。以上研究表明大量P450基因参与拟南芥的生物胁迫反应。P450参与植物抗黄萎病反应的研究也逐渐受到关注，棉花中黄萎病菌会诱导棉酚的大量合成，Luo等人发现黄萎病菌侵染后棉花中CYP706B1参与了棉酚的合成，推测CYP706B1可能在棉花抗黄萎病反应中发挥了一定的作用。Sun等从棉花中发现了一个P450家族新成员SSN(Silence-InducedStemNecrosis)基因，SSN基因表达被抑制后转基因棉花茎杆产生类病斑。进一步研究发现，SSN表达被抑制后转基因棉花根中茉莉酸的合成和信号路径组成型激活。SSN基因在棉花中超量表达和抑制表达后极显著影响了转基因植株根部的脂类代谢。脂类代谢异常使游离脂类成分或其衍生物作为系统信号激活了棉花地上部分的组成型免疫反应并产生细胞坏死。表明SSN在棉花基础免疫反应调控中起到一个开关的作用，通过调控脂类代谢影响棉花应对病原菌侵染后的抗性水平。该发现是迄今棉花抗黄萎病研究中取得的最重要的成果之一。此外，Prall等研究还发现CYP72A基因在茄科作物中变异程度最大，推测驯化过程中CYP72A基因的丢失可能也与野生种和栽培种的抗性差异有关。其他植物中，P450参与抗病反应的报道，如PepCYP调控辣椒炭疽病，CYP82C2参与葡萄灰霉病调控等，以上研究表明大量P450家族基因参与了植物抗病反应，并且P450家族基因调控植物黄萎病的研究也正逐渐受到关注。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种茄子抗黄萎病细胞色素P450基因的获得方法及其应用。本专利技术的专利技术理念为：充分利用分子育种的优势，从分子生物学方法的角度出发，利用RACE方法扩增、并对RACE产物测序、拼接，得到水茄StCYP84A基因cDNA全长；随后，对其进行生物信息学分析、测定黄萎病菌接种后该基因的表达量变化，同时检测过氧化物酶活性以进一步验证其功能，揭示该基因在黄萎病抗性中所发挥的作用，确定抗黄萎病基因。本专利技术提供了一种茄子细胞色素P450基因StCYP84A，具有序列表中SEQIDNO.1所示的核苷酸序列。该基因是茄子抗黄蒌病相关基因，是一条长度为2035bp的cDNA序列。该基因5’UTR含129bp，3’UTR含331bp。CDS全长1575bp,编码524个氨基酸。本专利技术还公开了该基因编码一种茄子抗黄萎病相关蛋白，其氨基酸序列如SEQIDNO.2所示，所述的氨基酸序列含有细胞色素氧化酶典型的保守结构域。本专利技术还提供了一种茄子细胞色素P450基因的获得方法，包括以下步骤：1)提取水茄样本总RNA；2)以步骤1)中所提取RNA反转录成的cDNA为模板，进行RACE-PCR扩增，得到水茄StCYP84A基因cDNA全长，在RACE-PCR扩增中所使用的特异引物的核苷酸序列如下：R1F：5’-TTCACTTCCCCCAGCAAGCCAGGTA-3’(SEQIDNO.3)R1R：5’-GTCCTACACCTTGCTTACCTTCCGTT-3’；(SEQIDNO.4)3)对步骤2)中所获得的PCR产物进行回收、测序与序列分析。上述方法步骤1)中，推荐使用水茄样本四片真叶时期的根为材料提取总RNA。本专利技术进一步公开了所述茄子细胞色素P450基因StCYP84A在抗黄萎病中的应用。本专利技术公开了所述的茄子细胞色素P450基因StCYP84A在植物分子标记辅助育种中的应用。本专利技术还提供了如上所述的茄子抗黄萎病相关蛋白，以及编码上述茄子抗黄萎病相关蛋白的基因在茄子黄萎病的研究、植物分子标记辅助育种和基因工程领域进行遗传性状的改良中的应用。本专利技术的基因对培育植物抗逆品种，特别是抗黄萎病茄子品种提高作物产量和品质具有重要意义。本专利技术的技术方案达到了如下的有益效果：1)本基因为水茄中的黄萎病抗性相关细胞色素氧化酶基因，实验表明该基因响应水茄对黄萎病抗性的调控过程，该基因的克隆及研究对理解茄子抗黄萎病机制具有一定的参考价值；2)该基因的获得既可作为茄子抗黄萎病分子标记辅助育种提供参考基因，也丰富了茄子等植物抗黄萎病转基因育种的基因选择，为茄子抗黄萎病分子育种奠定初步基础。附图说明图1是野生茄水茄根系RNA完整性的琼脂糖凝胶电泳检测结果。图2是基因全长序列琼脂糖凝胶电泳检测结果。图3是StCYP84A保守区预测。图4是StCYP84A跨膜结构域预测。图5是水茄中StCYP84A的表达分析。图6是鹰嘴长茄中StCYP84A的表达分析。具体实施方式为了阐明本专利技术的技术方案及技术目的，下面结合附图及具体实施方式对本专利技术做进一步的介绍。实施例1：本实施例1以野生茄水茄cDNA和基因组DNA为模板，使用RACE方法克隆了多酚氧化酶基因，具体步骤如下：1)孢子悬浮液的制备：茄子黄萎病菌经PDA培养基平板培养7天后，用解剖针从边缘挑取面积约1cm*1cm的菌丝块，移入PL培养液中，在摇床上以120rmp/min，25℃，震荡培养7-9天，此时PDA培养液(马铃薯葡萄糖琼脂培养基)由透明液体变成乳白色液体。将乳白色液体用双层纱布过滤，保留滤液，用血球计数板观察孢子数，计算出每毫升孢子数量，用灭菌蒸馏水稀释病菌孢子，最终配成浓度为1x107孢子/mL的孢子悬浮液，随即用于接种。2)采用浸根接菌法接种：从每个茄子品种中选取16株长势良好的幼苗，将幼苗拔起，用清水洗净根部，在幼苗根际1cm处断根，然后将根浸泡在茄子黄萎病病原菌孢子悬浮液(浓度1×107个/mL)中15min，随后立即定植到新的4x8的穴盘中(穴盘中基质经高温蒸汽灭菌)。白天温度控制在25～28℃左右，夜间20～22℃左右，空气湿度60-90％。分别取未接种前植株的叶片、茎段、根系和接种后6h、12h、24h、48h、96h植株的叶片、茎段、根系，经过液氮冷冻，-80℃保存。3)提取总RNA与基因组DNA：以水茄四片真本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种茄子细胞色素P450基因StCYP84A，其特征在于，具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。

【技术特征摘要】
1.一种茄子细胞色素P450基因StCYP84A，其特征在于，具有SEQIDNO.1所示的核苷酸序列。2.权利要求1所述的茄子抗黄萎病P450基因StCYP84A编码的蛋白，其特征在于具有SEQIDNO.2所示的氨基酸序列。3.一种茄子细胞色素P450基因StCYP84A的获得方法，其特征在于，包括以下步骤：1)提取水茄样本总RNA；2)以步骤1)中所提取RNA反转录成的cDNA为模板，进行RACE-PCR扩增，在RACE-PCR扩增中所使用的特异引物的核苷酸序列如下：R1F：5’-TTCACT...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨旭，张宇，王露，成玉富，
申请(专利权)人：扬州大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32