本发明专利技术提供了一种在生理pH条件下有活力的草酸氧化酶及其应用。其基因序列如SEQ ID NO.3所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示，属基因工程技术领域。该草酸氧化酶在pH7.4条件下的比活力不低于其最大比活力的20％，因此，含有草酸氧化酶的药物可以制成针剂或经肠溶材料包埋，为研发一种适用于治疗草酸过多疾病的重组草酸氧化酶药物提供了可能性。本发明专利技术也可以使用草酸氧化酶制备预防草酸过多疾病的药物。
A dynamic oxalate oxidase under physiological pH and its application
The present invention provides a dynamic oxalate oxidase under physiological pH conditions and its application. The gene sequence of SEQ ID NO.3 has shown that the amino acid sequence of SEQ ID NO.7 shows, which belongs to the technical field of gene engineering. The oxalate oxidase under the condition of pH7.4 specific activity of not less than the maximum specific activity of 20%, therefore, drugs containing oxalate oxidase can be made into injection or through enteric material embedding, provides the possibility for the development of a recombinant oxalate oxidase drug for the treatment of excessive oxalic acid disease. The invention can also use oxalate oxidase to prepare drugs for preventing excessive oxalate disease.
【技术实现步骤摘要】
一种在生理pH条件下有活力的草酸氧化酶及其应用
本专利技术涉及一种在生理pH条件下有活力的草酸氧化酶基因及其编码的蛋白与应用，尤其涉及该草酸氧化酶在用于制备降低草酸过多症疾病病人血液或尿液中草酸浓度的药物中的应用，属基因工程
技术介绍
泌尿系结石疾病是一种全球范围内的重大健康疾病，绝大多数泌尿系结石由草酸钙或草酸钙与磷酸钙成分组成。许多疾病均与人体内的草酸量过高有关，比如原发性高草酸尿症、第二高草酸尿症、孤独症、外阴痛、草酸过多引起的晚期肾结石疾病、心脏传导障碍、克罗恩氏症、炎症性肠病、结肠炎、泌尿性结石、哮喘、慢性阻塞性肺病、纤维肌痛、Zellweger综合征等，以及其他慢性疾病。原发性高草酸尿症(primaryhyperoxaluria，PH)包括I型，II型和III型，都是极为罕见的基因突变导致的乙醛酸盐代谢异常遗传疾病，该疾病因肝脏中特定代谢酶的缺失导致草酸在体内的过度积累：I型疾病因乙醛酸盐氨基转移酶缺失导致，II型疾病因乙醛酸/羟基丙酮酸还原酶缺失导致，III型疾病因肝脏特有的线粒体酶4-羟基-2-氧-戊二醛缩酶缺失导致，还有一些非以上三种类型的原发性高草酸尿疾病，原因正在进一步的研究中。原发性高草酸尿症疾病是一种非常严重的遗传病，晚期患者体内的血液中草酸浓度可达100μmol/L，远高于正常人草酸水平(<5μmol/L)，伴随着患者肾功能的衰竭，过饱和的草酸钙会在肾脏、甲状腺、心肌层、骨骼、皮肤、血管及眼中沉积形成结石，损坏人体重要器官，危及生命。第二高草酸尿症(secondaryhyperoxaluria，SH)是一种食源性草酸吸收过度或食入大量草酸前体导致的疾病，原因包括胃肠道疾病引起的，如肠炎、囊胞性纤维症、短肠综合征、或富含草酸食物或草酸前体饮食偏好。第二高草酸尿症是一种非常常见的疾病，其危害没有原发性高草酸尿症严重，但是高血草酸及尿草酸浓度仍然会让患者患上草酸过多引起的慢性疾病或晚期尿路系统衰竭。人体通过食源性吸收的草酸占泌尿草酸总量的10～70％不等，食物中的草酸可以通过整个胃肠道消化系统吸收，包括胃，小肠和大肠，因此在消化吸收系统器官中去除食物中的草酸可以有效的防止草酸被胃肠道吸收。业界公认，草酸钙浓度的过高会导致结石的形成，因此，降低草酸的浓度有助于降低结石形成的风险。需要长期进行透析的慢性肾功能衰竭(CRF)和肾功能衰竭晚期(ESRF)病人也很容易导致草酸过多症。该类病人的肾功能缺失导致草酸无法被有效清除，同时透析过程中需要注射维生素C作为抗氧化药物，而其在人体内会被代谢转化为草酸。此类病人体内血液中草酸一般在30-90μmol/L。2006年数据显示，美国每年有34万人需要透析，该人数还在一直上升，因此，该类病人也处于患草酸过多疾病的风险之中。Zellweger综合征(ZSD)病人也与草酸过多有很高的关联性(83％)，ZSD是一种过氧化物酶缺失导致的疾病，虽然ZSD病人草酸代谢异常的机理尚不清楚，但是ZSD病人体内的血草酸浓度与原发性高草酸尿症病人是差不多的。迄今为止几乎没有有效的治疗措施可以显著的降低草酸过多症患者形成结石的风险，其中最主要被使用的一些方法仅仅是通过口服草酸降解酶或草酸降解细菌来限制食物中草酸的吸收。然而，这些方法都会遇到一个共同的挑战，那就是胃环境中的强酸性加上高活力的胃蛋白酶会降解草酸降解酶蛋白，肠道中的胰蛋白酶和糜蛋白酶也会降解草酸降解酶。而且，大多数已知的草酸降解酶的最适pH值均为弱酸性，所以在中性偏碱的肠道中的无活力或活力很低。口服草酸降解菌同样遇到胃的强酸环境和肠道的蛋白酶解的挑战，无法形成优势菌群发挥降草酸作用。自然界中主要有两种草酸降解酶：草酸脱羧酶和草酸氧化酶(www.brenda-enzymes.org/)，然而并没有发现一种草酸脱羧酶在生理环境(pH7.4)有降解草酸活力。第一次被明确验证有草酸氧化酶活力的蛋白来自于大麦，其在大麦萌发过程中起重要作用，故又被称为萌发蛋白(germinprotein)。所有文献中曾报道的萌发蛋白类似的(germ-like)草酸氧化酶，其均在酸性条件下具有降解草酸的活力。有文章(Biochem.J.,1962,85,33)报道三角梅叶片在pH7.4条件下有草酸氧化酶活力，但是其提取溶液没有草酸氧化酶活力。报道的在pH>7下具有活力的草酸氧化酶，其氨基酸序列未知，WO2011/066282专利描述了一种草酸降解酶来自于真菌，其专利实施例5中的酶并没有被纯化出来，也没有任何序列信息，本专利专利技术人也曾尝试纯化该酶，但没有成功。MakotoK等人也曾发表过一篇文章(JournaloftheInstituteofBrewing,vol115,2009,232-237)，文章中说其来自于一种大麦种子和大麦芽的草酸氧化酶在中性pH下有活力。但是本专利专利技术人提取过相同种属的大麦中的草酸氧化酶，发现其在pH7.4并无草酸氧化酶活力。因此，寻找在生理pH条件下有活力的草酸氧化酶，并获得其氨基酸序列，实现基因工程重组表达，工业化生产，利用其降低人体中的草酸含量的治疗措施仍然是非常必要的。
技术实现思路
为了克服现有技术中的不足，本申请筛选了上千种植物样本，测试其在生理pH条件(pH7.4)下是否有草酸氧化酶活力，筛选到甜菜茎，香蕉皮，三角梅，夜来香，紫茉莉，守宫木，麻风树等候选物种，然后通过基因克隆手段克隆到编码草酸氧化酶的基因序列，通过基因工程重组表达系统(大肠杆菌，毕赤酵母，烟草及豌豆)重组表达，验证基因序列的正确性以及其草酸氧化酶的活力性质。本专利技术提供了一组在pH7.4条件下有活力的草酸氧化酶，可以降解草酸或草酸盐，其基因序列与SEQIDNO.1-4中任意一项至少有50％的一致性。本专利技术提供了一组在pH7.4条件下有活力的草酸氧化酶，可以降解草酸或草酸盐，其基因序列与SEQIDNO.1-4中任意一项至少有55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，95％，98％，99％，100％的一致性。本专利技术的另一个目的是提供一组在pH7.4条件下有活力的草酸氧化酶，可以降解草酸或草酸盐，其氨基酸序列与SEQIDNO.5-8中任意一项至少有50％的一致性。本专利技术还提供一组在pH7.4条件下有活力的草酸氧化酶，可以降解草酸或草酸盐，其氨基酸序列与SEQIDNO.5-8中任意一项有至少55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，95％，98％，99％，100％的一致性。以上草酸氧化酶可以从甜菜茎，香蕉皮，三角梅，夜来香，紫茉莉，守宫木，麻风树等植物物种中提取得到。本专利技术还提供一组在pH7.4条件下有活力的草酸氧化酶，可以降解草酸或草酸盐，是用不同分子量的聚乙二醇修饰的草酸氧化酶。所述的聚乙二醇的分子量是2kD,5kD,10kD,20kD,4臂-20kD,30kD,40kD或4臂-40kD中的任意一种。本专利技术提供一种包含草酸氧化酶基因的表达载体，其中草酸氧化酶基因序列与SEQIDNO.1-4中任意一项至少有50％的一致性。本专利技术提供一种包含草酸氧化酶基因的表达载体，其中草酸氧化酶基因序列与SEQIDNO.1-4中任意一项至少有55％，60％，65％，70％，75％，8本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种草酸氧化酶，在生理pH条件下可以降解草酸或草酸盐，其特征在于：其基因序列如SEQ ID NO.3所示。
【技术特征摘要】
1.一种草酸氧化酶，在生理pH条件下可以降解草酸或草酸盐，其特征在于：其基因序列如SEQIDNO.3所示。2.根据权利要求1所述的草酸氧化酶，其特征在于：其氨基酸序列如SEQIDNO.7所示。3.权利要求2所述的草酸氧化酶，其特征在于：是不同分子量的聚乙二醇修饰的草酸氧化酶。4.根据权利要求3所述的草酸氧化酶，其特征在于：所述的聚乙二醇的分子量是2kD,5kD,10kD,20kD,4臂-20kD,30kD,40kD或4臂-40kD中的任意一种。5.一种表达载体，包含权利要求1中的基因序列。6.一种重组表达菌株，包含权利要求5所述的表达载体，可以产生权利要求2所述的草酸氧化...
【专利技术属性】
技术研发人员：王怡，汪小锋，刘海峰，汪卫，
申请(专利权)人：武汉康复得生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：湖北,42
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