用于生产草酸脱羧酶的重组质粒、大肠杆菌表达系统及方法和应用技术方案

本发明专利技术公开了用于生产草酸脱羧酶的重组质粒、大肠杆菌表达系统及方法和应用。所述用于生产草酸脱羧酶的重组质粒，包含：草酸脱羧酶基因、分子伴侣基因和调控胞内锰离子浓度的基因。本发明专利技术将所述重组质粒导入大肠杆菌表达菌株和MntP基因缺失的大肠杆菌中，均得到可溶表达且有活性的草酸脱羧酶。并对重组菌株的培养温度和诱导温度进行了优化，发现培养温度为37℃，诱导温度为25℃时，草酸脱羧酶的表达量较高。通过有机溶剂沉淀和硫酸铵沉淀两步简单纯化，草酸脱羧酶比活力能达到45.6U/mg，纯度超过95％。本发明专利技术技术方案具有生产和纯化工艺简单，草酸脱羧酶的表达量和比活力高，易于工业放大，成本低，有利于草酸脱羧酶的工业化生产和应用。

【技术实现步骤摘要】
用于生产草酸脱羧酶的重组质粒、大肠杆菌表达系统及方法和应用
本专利技术属于生物
，具体涉及用于生产草酸脱羧酶的重组质粒、大肠杆菌表达系统及方法和应用。
技术介绍
草酸(Oxalicacid)，是生物体的一种代谢产物，又叫乙二酸(Ethanedioicacid)，广泛分布于植物、动物和真菌体中，并在不同的生命体中发挥不同的功能。目前的研究发现至少有100多种植物富含草酸，尤以菠菜、苋菜、甜菜、马齿苋、芋头、茶叶、可可、甘薯和大黄等植物的叶片和种子中含量最高，由于草酸可降低矿质元素的生物利用率，在人体中容易与钙离子形成草酸钙导致肾结石，所以草酸往往被认为是一种矿质元素吸收利用的拮抗物。草酸在人体内不容易被氧化分解掉，经代谢作用后形成的产物，属于酸性物质，可导致人体内酸碱度失去平衡，吃得过多还会中毒。而且草酸在人体内如果遇上钙和锌离子便生成草酸钙和草酸锌，不易吸收而排出体外，影响钙与锌的吸收。儿童生长发育需要大量的钙和锌，如果体内缺乏钙和锌，不仅可导致骨骼、牙齿发育不良，而且还会影响智力发育，过量摄入草酸还会造成人体内血液和尿液中的草酸含量过高，容易与钙离子形成不溶性的草酸钙晶体，草酸钙晶体很容易形成泌尿系结石。因此，控制从饮食中摄取的草酸，很大程度上就可以降低尿草酸量，从而降低患结石风险。低草酸饮食或降解食物中的草酸以防治草酸钙结石的策略在医学界已成为共识。泌尿系结石是泌尿系统的常见病和多发病，全球有10％的人会患此疾病，该病的主要特点是临床治愈后复发率较高，给患者带来了极大的痛苦，给家庭带来了沉重的心理和经济上的负担。草酸钙是泌尿系结石的主要成分，占比达80％，导致草酸钙结石症的重要原因是人体内缺乏降解草酸的代谢途径。近年来，研究酶法降解草酸预防治疗草酸钙结石症成为该领域的研究热点(贺俊斌,林日辉,龙寒等.草酸降解酶预防治疗草酸钙结石症的研究进展.广东医学,36(7):1132-1136)。目前生物界降解草酸的酶包括草酸氧化酶(Oxalateoxidase,EC1.2.3.4)、草酸脱羧酶(Oxalatedecarboxylase,EC4.1.1.2，以下简称OXDC)和草酰辅酶A脱羧酶(Oxaly1-coenzymeAdecarboxylase,EC4.1.1.8)。OXDC是将草酸分解为甲酸和二氧化碳的酶，其内部含有锰。迄今已知，许多细菌(芽胞杆菌(Bacillus)属，集胞藻和乳酸菌属等、霉菌(曲霉(Aspergillus)属等)、金针菇(Flammulinavelutipes)，彩绒革盖菌(Coriolusversicolor)，疣孢漆斑菌(Myrotheciumverrucaria)，白腐菌(Trametesversicolor),褐腐菌属(Monilinia)等)含有草酸脱羧酶基因(以下也称“oxdc基因”)。草酸脱羧酶在上述物种中的表达量极低，而且多数菌种生长缓慢，成分复杂，分离提取纯化十分困难，不具备商业化应用可能，所以将草酸脱羧酶进行重组表达生产成为其商业化应用的必然选择。目前草酸脱羧酶中实现原核重组表达的还比较少，多数是在大肠杆菌中进行重组表达(MeenuKesarwani,etal.OxalateDecarboxylasefromCollybiavelutipes.JournalofBiologicalChemistry,2000,275(10):7230-7238；J.Biol.Chem.276(2001)，43627-43634；专利文献CN102597225B,CN201610217032和CN101918551B),也有个别用枯草芽胞杆菌表达芽胞杆菌来源的oxdc基因的报道(专利文献CN201610217032)。金针菇来源的OXDC有通过烟草表达成功过报道，但表达量极低。大肠杆菌中表达真菌来源的OXDC存在酶活力低，不能实现分泌表达，非常易于形成包涵体，复性和纯化困难。真菌来源的OXDC多数在酸性pH条件下酶活力较高且较为稳定，溶解状态的OXDC对环境的pH比较敏感。在大肠杆菌中共表达分子伴侣和真核生物来源的草酸脱羧酶，同时过表达锰离子通道相关蛋白，以促进草酸脱羧酶表达的研究，目前尚未有文献报道。。
技术实现思路
为了解决现有技术中，在大肠杆菌表达真核生物来源的草酸脱羧酶常常得到无活性的包涵体，且复性工艺复杂，成本高的问题，本专利技术的目的是提供生产草酸脱羧酶的重组质粒及包含所述重组质粒的大肠杆菌表达系统，利用该质粒/系统可以生产有活性的草酸脱羧酶。本专利技术的另一目的在于提供利用所述大肠杆菌表达系统生产草酸脱羧酶的方法及应用。为实现上述目的，本专利技术采用的技术方案是：生产草酸脱羧酶的重组质粒，包含：草酸脱羧酶基因、分子伴侣基因、促进锰离子泵入相关的通道蛋白/调控蛋白基因。所述促进锰离子泵入相关的通道蛋白/调控蛋白基因包括：锰离子泵入基因MntH、锰离子伴侣基因MntS、锰转录调节基因OxyR(大肠杆菌抗氧化系统的调节因子)等，专利技术人经研究发现，所述的重组质粒包含草酸脱羧酶基因、分子伴侣基因、促进锰离子泵入相关的通道蛋白/调控蛋白基因时，非常有利于促进草酸脱羧酶的可溶且有活性表达。本专利技术提供的技术方案与传统的技术相比具有以下优势：(1)利用所述重组质粒进行表达的草酸脱羧酶大部分是可溶且有活性的，比活力高；(2)即使存在少量不可溶的包涵体，也是属于非典型包涵体，通过简单纯化或缓冲液溶解就可得到有活性的可溶酶；(3)草酸脱羧酶的分离纯化工艺简单；(4)总生产成本低，有利于工业化应用。优选的，所述促进锰离子泵入相关的通道蛋白/调控蛋白基因为：来源于大肠杆菌的OxyR基因或与所述OxyR基因编码的蛋白有类似功能的来源于其他物种的基因。所述OxyR基因为促进锰离子泵入大肠杆菌胞内的调控蛋白基因，专利技术人发现在所有促进锰离子泵入相关的通道蛋白/调控蛋白基因中，OxyR基因促进草酸脱羧酶的可溶且有活性的表达最优。所述OxyR基因及其终止子DNA片段如序列表SEQIDNO.3所示，可通过大肠杆菌K-12菌株的基因组扩增得到。所述分子伴侣基因可以为dnaK-dnaJ-grpE、groES-groEL、groES-groEL-tig或tig中的任意一种或多种；优选的，所述分子伴侣基因为groES-groEL基因，所述分子伴侣基因的启动子选自P43启动子或/和M1-93启动子。所述M1-93启动子序列如序列表SEQIDNO.2所示，所述P43启动子序列如序列表SEQIDNO.4所示，均可通过全基因合成。构建表达分子伴侣基因的大肠杆菌菌株，表达分子伴侣的质粒可以选用Takara公司的ChaperonePlasmidSet系列质粒，包括pG-KJE8、pGro7、pKJE7、pG-Tf2和pTf16；优选分子伴侣质粒为pG-KJE8、pGro7或pG-Tf2，最优选分子伴侣质粒为pGro7。优选的，所述草酸脱羧酶为草酸脱羧酶A2，基因序列如序列表SEQIDNO.1所示，所述草酸脱羧酶A2基因编码对应的氨基酸序列如SEQIDNO.5所示。本专利技术还提供包含所述重组质粒的大肠杆菌表达系统。所述的大肠杆菌表达系统中所用的大肠杆菌载体选自pET系列载体、pCold系列、pGEX系列载体、pCOLADuet-本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.用于生产草酸脱羧酶的重组质粒，其特征在于，包含：草酸脱羧酶基因、分子伴侣基因、促进锰离子泵入相关的通道蛋白/调控蛋白基因。

【技术特征摘要】
1.用于生产草酸脱羧酶的重组质粒，其特征在于，包含：草酸脱羧酶基因、分子伴侣基因、促进锰离子泵入相关的通道蛋白/调控蛋白基因。2.根据权利要求1所述的用于生产草酸脱羧酶的重组质粒，其特征在于，所述促进锰离子泵入相关的通道蛋白/调控蛋白基因为：来源于大肠杆菌的OxyR基因或与所述OxyR基因编码的蛋白有类似功能的来源于其他物种的基因。3.根据权利要求1所述的用于生产草酸脱羧酶的重组质粒，其特征在于，所述分子伴侣基因为groES-groEL基因，所述分子伴侣基因的启动子选自P43启动子或/和M1-93启动子。4.包含权利要求1～3任一项所述重组质粒的大肠杆菌表达系统。5.根据权利要求4所述的大肠杆菌表达系统，其特征在于，还包含有敲除或抑制或失活MntP基因的宿主菌株。6.根据权利要求4所述的大肠杆菌表达系统，其特征在于，所述宿主菌株为Origami2(D...

【专利技术属性】
技术研发人员：汪小锋，吴玉峰，汪卫，刘艳红，陈火晴，
申请(专利权)人：武汉康复得生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：湖北,42