一种TALE表达载体及其快速构建方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种TALE表达载体及其快速构建方法和应用，该TALE载体为由组装的环状5联体和TALE骨架载体组装形成的最终功能性TALE表达载体，组装的环状5联体由62个单体经酶切‑连接反应形成。本发明专利技术的TALE表达载体为可在一天内快速装配定制型TALE载体，消除现有技术中TALE应用的障碍，可以激活外源报告基因和内源基因的表达。本发明专利技术TALE表达快速构建TALE载体的方法，制备62个新单体用这些单体可在一天内快速装配定制型TALE载体，本发明专利技术通过设计和装配针对转录因子基因HNF4α和E47启动子的9个TALE载体验证了方法的可行性，并鉴定出两个可用于肝癌及胰腺癌分化疗法的TALE载体。

【技术实现步骤摘要】
一种TALE表达载体及其快速构建方法和应用
本专利技术属于基因调控以基因编辑
，具体涉及一种TALE表达载体及其快速构建方法和应用。
技术介绍
目前，使用最广泛的基因操作技术是锌指(ZF)，转录激活因子样效应物(TALE)和规律成簇间隔短回文重复序列(CRISPR)系统。ZF是最早可编程的DNA结合域，它使得ZF模块阵列能够组装成串联阵列并靶向基因组中的新型DNA结合位点。ZF阵列中的每个指模都以三个DNA碱基为目标。TALE是第二代可编程DNA结合域。并且TALE-DNA结合单体靶向单核苷酸比ZF更加模块化。TALE理论上可以针对任何序列，而且已经在许多生物体中得到应用并取得了令人瞩目的成功。更重要的是，基于TALE的DNA结合模块比ZF具有更高的序列特异性，更低的脱靶率和更低的细胞毒性。TALE是来自黄单胞菌属植物致病菌的III型效应蛋白。所有的TALE由N-末端易位结构域，C-末端核定位信号与酸性转录激活结构域和中央串联重复DNA结合结构域组成，其中中央串联重复DNA结合结构域由含有34个氨基酸序列(称为单体)的串联重复DNA识别和结合所构成。天然产生的TALE被发现具有本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种TALE载体，其特征在于，所述TALE载体为由组装的环状5联体和TALE骨架载体组装形成的最终功能性TALE表达载体，所述组装的环状5联体由62个单体经酶切‑连接反应形成。

【技术特征摘要】
1.一种TALE载体，其特征在于，所述TALE载体为由组装的环状5联体和TALE骨架载体组装形成的最终功能性TALE表达载体，所述组装的环状5联体由62个单体经酶切-连接反应形成。2.根据权利要求1所述的TALE载体，其特征在于，所述62个单体为可用一对通用引物进行高通量PCR扩增制备的62个单体。3.根据权利要求1所述的TALE载体，其特征在于，所述62个单体为无冗余序列的线状双链DNA片段。4.根据权利要求1所述的TALE载体，其特征在于，所述62个单体均以一对恒定序列结尾，所述恒定序列为一对通用PCR引物的退火位点。5.根据权利要求1所述的TALE载体，其特征在于，所述62个单体由60个碱基决定单体和2个连接单体构成，其中碱基决定单体编码的氨基酸序列可结合一种碱基，连接单体仅起TALE载体组装中的连接作用，不结合碱基。6.根据权利要求1所述的TALE载体，其特征在于，所述62个单体含有不同的IIS类限制酶切点，可通过酶切-连接反应按设定顺序连接。7.根据权利要求7所述的TALE载体，其特征在于，所述组装的环状5联体，包括4个环状5联体，其中第一个环状5联体由5个碱基决定单体经酶切-连接反应组装而成，可编码结合TALE结合靶点的第1～5个碱基的氨基酸序列；第二个环状5联体由5个碱基决定单体经酶切-连接反应组装而成，可编码结合TALE结合靶点的第6～10个碱基的氨基酸序列；第三个环状5联体由四个碱基决定单体和一个连接单体经酶切-连接反应组装而成，可编码结合TALE结合靶点的第11～14个碱基的氨基酸序列；第四个环状5联体由四个碱基决定单体和一个连接单体经酶切-连接反应组装而成，可编码结合TALE结合靶点的第15～18个碱基的氨基酸序列。8.根据权利要求1所述的TALE载体，其特征在于，所述TALE骨架载体优选为含有启动子、TALE恒定N端序列、TALEDNA结合序列插入位点、TALE恒定C端序列以及编码某种功能性结构域的序列。9.根据权利要求8所述的TALE载体，其特征在于，所述最终功能性...

【专利技术属性】
技术研发人员：王进科，张书衍，
申请(专利权)人：东南大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32