提升大肠杆菌角鲨烯含量用质粒pCDAF及其制备和使用方法技术

本发明专利技术公开了一种提升大肠杆菌中角鲨烯含量的方法，具体通过增生大肠杆菌的内膜进行，本发明专利技术还公开了一种质粒pCDAF，通过大量表达ATP合酶b亚基基因atpF促使大肠杆菌内膜增生，本发明专利技术还公开了该质粒pCDAF的制备和使用方法。本发明专利技术的技术方案，通过表达ATP合酶b亚基基因atpF促使细胞内膜增生使角鲨烯及其合成前体物的储存空间增加，最终提高角鲨烯的积累量，通过质粒pCDAF用于促使大肠杆菌中内膜的增生，含有链霉素抗性基因作为筛选标记，以强启动子PT7控制ATP合酶b亚基基因atpF的表达以提高其表达量。

Plasmid pCDAF for Enhancing Squalene Content in Escherichia coli and Its Preparation and Application

The invention discloses a method for increasing squalene content in Escherichia coli, which is carried out by proliferating the inner membrane of Escherichia coli. The invention also discloses a plasmid pCDAF, which promotes the inner membrane proliferation of Escherichia coli by expressing ATP synthase B subunit gene atpF in large quantities. The invention also discloses the preparation and use method of the plasmid pCDAF. \u3002 The technical scheme of the present invention is that squalene and its synthetic precursor storage space is increased by expressing ATP synthase B subunit gene atpF, and squalene accumulation is eventually increased. The plasmid pCDAF is used to promote the intimal proliferation of E.coli, and the streptomycin resistance gene is used as a screening marker to enhance squalene and its synthetic precursor storage space. Promoter PT7 controls the expression of ATP synthase B subunit gene atpF to increase its expression.

【技术实现步骤摘要】
提升大肠杆菌角鲨烯含量用质粒pCDAF及其制备和使用方法
本专利技术属于生物基因工程领域，特别是涉及一种提升大肠杆菌角鲨烯含量的方法，还涉及一种提升大肠杆菌角鲨烯含量用质粒pCDAF，还涉及一种该pCDAF的制备方法，还涉及一种该质粒pCDAF的使用方法。
技术介绍
角鲨烯是一种天然存在于多种微生物及动植物细胞内的三萜烯类化合物，具有抗氧化，保护心脏，提高免疫力，降低血脂及抑制癌症发展等多种功效，已被广泛应用于医药及保健品领域。当前，市面上的角鲨烯主要来源于植物种子及动物肝脏的提取，因此价格比较昂贵，另外通过提取的方法获得还具有周期长、成本高、破坏环境等缺点，因此，亟需新的更环保、更廉价的生产方式。微生物发酵生产活性化合物具有廉价、快速、环保等优点。近年来，诸多研究致力于利用酵母、微藻及沼泽红假单胞菌等微生物进行角鲨烯的发酵生产，但均未实现突破，其产量与工业化生产要求尚有较大差距。究其原因，角鲨烯含量低或发酵密度低等因素限制了角鲨烯的最终产量。大肠杆菌(Escherichiacoli,E.coli)作为模式菌，具有研究透彻、易改造、易培养等特点，是发酵生产活性化合物的理想菌之一。目前本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种提升大肠杆菌中角鲨烯含量的方法，其特征在于，通过增生大肠杆菌的内膜进行；所述大肠杆菌为可合成角鲨烯的大肠杆菌E.coli CSQ1，所述大肠杆菌E.coli CSQ1是先通过将野生菌株E.coli C43(DE3)制备成氯化钙感受态细胞后，再通过热击法转化质粒pTsqs，最后利用氨苄青霉素抗性筛选和菌落PCR验证获得的，所述质粒pTsqs的核苷酸序列表如序列1所示。

【技术特征摘要】
1.一种提升大肠杆菌中角鲨烯含量的方法，其特征在于，通过增生大肠杆菌的内膜进行；所述大肠杆菌为可合成角鲨烯的大肠杆菌E.coliCSQ1，所述大肠杆菌E.coliCSQ1是先通过将野生菌株E.coliC43(DE3)制备成氯化钙感受态细胞后，再通过热击法转化质粒pTsqs，最后利用氨苄青霉素抗性筛选和菌落PCR验证获得的，所述质粒pTsqs的核苷酸序列表如序列1所示。2.一种质粒pCDAF，用于权利要求1所述大肠杆菌的内膜增生，其特征在于，包括载体pCDFDuet-1，载体pCDFDuet-1内插入有阻碍蛋白表达基因lacI、大肠杆菌复制起始位点CDFori、链霉素抗性基因和ATP合酶b亚基基因atpF，ATP合酶b亚基基因atpF上游具有PT7启动子以启动ATP合酶b亚基基因atpF的表达；所述质粒pCDAF的核苷酸序列如序列2所示。3.一种权利要求2所述质粒pCDAF的制备方法，其特征在于，具体按照以下步骤实施：步骤1，先依据大肠杆菌E.coliCSQ1的基因atpF设计一对引物，之后以基因组为模板通过菌落PCR获得上下游分别含有NdeI与KpnI酶切位点的基因atpF，基因atpF的核苷酸序列表如序列3所示；步骤2，先后通过酶切和连接方法将将步骤1得到的基因atpF插入载体pCDFDuet-1的NdeI与KpnI酶切位点之间，构建得到质粒pCDAF；步骤3，利用菌落PCR与双酶切方法对质粒pCDAF进行验证。4.根据权利要求3所述的质粒pCDAF的制备方法，其特征在于，在所述步骤1中，所述一对引物如下：atpF_F_NdeI：5’-GGAATTCCATATGGTG...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐文，姚佳，马茜，李薇，孙晓敬，汪洋，
申请(专利权)人：西安医学院，
类型：发明
国别省市：陕西,61