一种人源硒蛋白H的原核表达纯化方法技术

本发明专利技术涉及一种人源硒蛋白H的原核表达纯化方法，该方法将人神经母细胞瘤SK‑N‑SH细胞的RNA转录为cDNA，进一步用PCR方法获得人硒蛋白H基因，并将该基因连接到原核表达载体中，转化至大肠杆菌中进行诱导表达，表达产物用Glutathione‑Sepharose TM4B纯化。本发明专利技术的方法能够在保证不突变硒蛋白H的硒代半胱氨酸活性的前提下在大肠杆菌中表达硒蛋白H。

【技术实现步骤摘要】
一种人源硒蛋白H的原核表达纯化方法
本专利技术涉及基因工程领域，具体地，涉及一种人源硒蛋白H的原核表达纯化方法。
技术介绍
硒(Selenium)是人体重要的微量元素之一。近年来的研究表明硒与心血管疾病、肿瘤、神经系统等疾病有关，其参与甲状腺激素代谢、抗氧化系统使机体发挥正常免疫功能。硒蛋白(Selenoprotein)是近年来发现的一类通过特殊编码机制编码的蛋白质。硒以硒代半胱氨酸(Sec)的形式，利用三个终止密码子之一的UGA作为三联体密码子，通过一套高度特化的编码和合成机制编码到蛋白质中，因此Sec被认为是生物体内的第21种氨基酸。目前已知的其它硒蛋白在原核大肠杆菌中的表达纯化方式大都是将其中的硒代半胱氨酸(Sec)突变为容易编码的半胱氨酸，即将编码硒代半胱氨酸的UGA密码子变为UGC，将A碱基突变为C碱基，然后再进行后续的纯化步骤。然而，这种方法得到的蛋白会影响硒蛋白利用硒代半胱氨酸所发挥的功能活性，因此，需要真核生物硒蛋白H在原核生物中不突变其硒代半胱氨酸密码子的表达的新技术。
技术实现思路
为了解决上述技术问题的至少一个，本专利技术提供一种人源硒蛋白H的原核表达纯化方法，包括以下步骤：(1)克隆人硒蛋白H的基因，用反转录PCR法扩增硒蛋白H的基因；(2)将上述扩增的硒蛋白基因与表达载体连接，构建人硒蛋白H基因表达载体；(3)将上述表达载体转化到用于克隆的大肠杆菌，挑选阳性克隆提取质粒，转化至用于表达的大肠杆菌，得到重组后的大肠杆菌；(4)诱导上述重组后的大肠杆菌，使其表达人硒蛋白H；(5)纯化人硒蛋白H：a.收集菌体溶于加入蛋白酶抑制剂的PBS中超声破碎，取细菌裂解上清；b.利用Glutathione-SepharoseTM4B进行纯化。在本专利技术的实施方案中，所述反转录PCR法扩增硒蛋白H的基因的引物如SEQIDNO:1和SEQIDNO:2所示。在本专利技术的实施方案中，所述反转录PCR法扩增硒蛋白H的PCR程序为：95℃预变性3min；95℃变性15s，60℃退火15s，共35个循环；终延伸72℃5min。在本专利技术的实施方案中，将所述硒蛋白基因与表达载体连接的方法为：表达载体为任一表达载体，用相同的限制性内切酶对PCR产物和表达载体进行酶切，纯化酶切后的PCR产物和表达载体，用T4连接酶将纯化的PCR产物与表达载体连接。在本专利技术的实施方案中，所述表达载体为pGEX-6p-1，所述限制性内切酶为XhoI和EcoRI。在本专利技术的实施方案中，所述用于克隆的大肠杆菌为DH5α，所述用于表达的大肠杆菌为BL21。在本专利技术的实施方案中，所述诱导重组后的大肠杆菌表达人硒蛋白H的方法为：将重组后的大肠杆菌接种于含氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃、250rpm振荡培养12h，之后按1：100倍扩大培养，于37℃继续振荡培养4h，加IPTG至终浓度为1mmol/L，于37℃诱导表达6hr。在本专利技术的实施方案中，所述利用Glutathione-SepharoseTM4B进行纯化的步骤为：将Glutathione-SepharoseTM4B介质充分混匀后，取2mL加入到放了一片筛板的层析柱中，用5倍柱体积自备去离子水洗柱，共三次；用5倍柱体积的结合缓冲液洗柱，共三次；将所述上清液加入纯化介质，4℃结合1小时；用10倍柱体积的结合缓冲液洗柱，将未结合的杂蛋白洗去；进一步用已配置的洗脱液洗柱，收集并保存穿透液，即得到纯化后的人硒蛋白H。在本专利技术的实施方案中，所述结合缓冲液的配方为Nacl(140mmol/L)，KCL(2.7mmol/L)，Na2HPO4(10mmol/L)，KH2PO4(1.8mmol/L)，最终pH值调至9.7；所述洗脱液的配方为：Tris-HCL(50mmol/L)，还原型谷胱甘肽(50mmol/L)，最终pH值调至9.7。在本专利技术的实施方案中，进一步地，所述方法还包括利用蛋白免疫印迹法鉴定纯化后的人硒蛋白H的步骤。优选地，所述蛋白免疫印迹法为WesternBlot方法。在本专利技术的实施方案中，在蛋白免疫印迹前还包括利用SDS-PAGE电泳验证的步骤。附图说明图1示出了利用本专利技术的方法纯化得到的人硒蛋白H经免疫沉淀鉴定的结果。具体实施方式为了使本专利技术所解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本专利技术进行进一步详细说明。实施例以下例子在此用于示范本专利技术的优选实施方案。本领域内的技术人员会明白，下述例子中披露的技术代表专利技术人发现的可以用于实施本专利技术的技术，因此可以视为实施本专利技术的优选方案。但是本领域内的技术人员根据本说明书应该明白，这里所公开的特定实施例可以做很多修改，仍然能得到相同的或者类似的结果，而非背离本专利技术的精神或范围。除非另有定义，所有在此使用的技术和科学的术语，和本专利技术所属领域内的技术人员所通常理解的意思相同，在此公开引用及他们引用的材料都将以引用的方式被并入。那些本领域内的技术人员将意识到或者通过常规试验就能了解许多这里所描述的专利技术的特定实施方案的许多等同技术。这些等同将被包含在权利要求书中。实施例1(一)材料大肠杆菌BL21、DH5α购自天根生化科技(北京)有限公司。原核表达载体为pGEX-6p-1。IPTG购自碧云天生物技术公司。引物合成、测序技术由华大基因公司完成。构建载体的试剂盒购自南京诺唯赞公司。Glutathione-SepharoseTM4B购自GE公司，其它试剂均为国产分析纯。(二)方法1.SelenoH的cDNA克隆使用TRIZOL提取人神经母细胞瘤SK-N-SH细胞的总RNA，RT-PCR方法扩增获得硒蛋白H(SelenoH)基因(GeneID：280636)的cDNA，以此为模板经上下游引物PCR扩增得到SelneoH全长的产物。上游引物(SEQIDNO:1)：CCCCTGGGATCCCCGGAATTCATGGCTCCCCGCGGGAGGAAG下游引物(SEQIDNO:2)：GTCACGATGCGGCCGCTCGAGACAATGCCTTACTAGAGGGTTGCPCR的参数如下：95℃预变性3min；95℃变性15s，60℃退火15s，共35个循环；终延伸72℃5min。2.pGEX-6p-1-SelenoH载体的构建。将载体pGEX-6p-1进行双酶切，酶为XhoI和EcoRI，将PCR产物和双酶切后的载体经切胶回收后，利用试剂盒进行连接。连接完成后转化大肠杆菌感受态细胞DH5α。挑取单克隆后，进行菌液PCR，获得阳性克隆后，送测序鉴定准确后，提取质粒。3.转化到大肠杆菌感受态细胞BL21。4.目的蛋白的诱导表达。将含有表达载体pGEX-6p-1-SelenoH的菌株，接种于LB液体培养基中(含氨苄青霉素)，37℃、250rpm振荡培养过夜(约12h)，次晨，按1：100倍扩大培养，于37℃继续振荡培养4h。加异丙基B—D-硫代半乳糖苷(IPTG)至终浓度为1mmol/L，于37℃诱导表达6h。离心、收集菌体溶于加入蛋白酶抑制剂的PBS中超声破碎，取细菌裂解上清及沉淀部分，进行SDS-PAGE电泳分析，用蛋白免疫印迹法观察。上清部分存在表达产物，将上清部分继续做后续的纯化部分。5.目的蛋白的纯化。结合液：Nacl(140mmol/L)，本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种人源硒蛋白H的原核表达纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）克隆人硒蛋白H的基因，用反转录PCR法扩增硒蛋白H的基因；（2）将上述扩增的硒蛋白基因与表达载体连接，构建人硒蛋白H基因表达载体；（3）将上述表达载体转化到用于克隆的大肠杆菌，挑选阳性克隆提取质粒，转化至用于表达的大肠杆菌，得到重组后的大肠杆菌；（4）诱导上述重组后的大肠杆菌，使其表达人硒蛋白H；（5）纯化人硒蛋白H：a. 收集菌体溶于加入蛋白酶抑制剂的PBS中超声破碎，取细菌裂解上清；b.利用Glutathione‑Sepharose TM4B进行纯化。

【技术特征摘要】
1.一种人源硒蛋白H的原核表达纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）克隆人硒蛋白H的基因，用反转录PCR法扩增硒蛋白H的基因；（2）将上述扩增的硒蛋白基因与表达载体连接，构建人硒蛋白H基因表达载体；（3）将上述表达载体转化到用于克隆的大肠杆菌，挑选阳性克隆提取质粒，转化至用于表达的大肠杆菌，得到重组后的大肠杆菌；（4）诱导上述重组后的大肠杆菌，使其表达人硒蛋白H；（5）纯化人硒蛋白H：a.收集菌体溶于加入蛋白酶抑制剂的PBS中超声破碎，取细菌裂解上清；b.利用Glutathione-SepharoseTM4B进行纯化。2.根据权利要求1所述人源硒蛋白H的原核表达纯化方法，其特征在于，所述反转录PCR法扩增硒蛋白H的基因的引物如SEQIDNO:1和SEQIDNO:2所示。3.根据权利要求2所述人源硒蛋白H的原核表达纯化方法，其特征在于，所述反转录PCR法扩增硒蛋白H的PCR程序为：95℃预变性3min；95℃变性15s，60℃退火15s，共35个循环；终延伸72℃5min。4.根据权利要求1或2所述人源硒蛋白H的原核表达纯化方法，其特征在于，将所述硒蛋白基因与表达载体连接的方法为：表达载体为任一表达载体，用相同的限制性内切酶对PCR产物和表达载体进行酶切，纯化酶切后的PCR产物和表达载体，用T4连接酶将纯化的PCR产物与表达载体连接。5.根据权利要求3所述人源硒蛋白H的原核表达纯化方法，其特征在于，所述表达载体为pGEX-6p-1，所述限制性内切酶为XhoI和EcoRI。6.根据权利要求1或2所述人源硒蛋白H的原核表达纯化方法，其特征在于，所述用于...

【专利技术属性】
技术研发人员：祝建洪，孙胜楠，张雄，范辉辉，
申请(专利权)人：温州医科大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33